本发明专利技术涉及从组合物中提纯白细胞介素－１５／Ｆｃ融合蛋白的方法，该方法包括ａ）将该组合物施加于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一ＩＬ－１５／Ｆｃ洗脱液和ｂ）将步骤ａ）的洗脱液用于离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二ＩＬ－１５／Ｆｃ洗脱液；还涉及纯化的白细胞介素－１５／Ｆｃ融合蛋白和包含这种融合蛋白的组合物，特别是药学组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从组合物中提纯白细胞介素-15/Fc融合蛋白的方法，该方法包括a)将该组合物用于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一IL-15/Fc洗脱液和b)将步骤a)的洗脱液用于离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液；还涉及纯化的白细胞介素-15/Fc融合蛋白和包含这种融合蛋白的组合物，特别是药学组合物。
技术介绍
器官或组织移植已经成为标准方法，并且在许多情况下，是许多威胁生命的疾病的唯一救生治疗法。然而，在受体器官的排异反应方面常常产生困难，排异反应是由对移植物的外源细胞表面抗原的免疫响应造成的。抑制排异反应的一种治疗途径是通过免疫抑制物，特别是通过拮抗性白细胞介素-15(IL-15)或白细胞介素-2(IL-2)抗体或激动剂来抑制体液或细胞免疫响应。之前已经描述了使用IL-15或IL-2分子的抗体的各种治疗法。有效的IL-15拮抗剂的一个例子是由N-末端突变或未突变的IL-15片段和C-末端的Fc片段组成的融合蛋白(WO97/41232；Kim等(1998)J.Immunol.1605742-5748)。为了能够成功地使用融合蛋白作为药物，必须能够以非常高的纯度大规模制备它们并以稳定的方式储存。通常，通过基因工程法制备非天然生成的蛋白质。为此，在细胞培养中制备所述蛋白质，在该培养中，已经对哺乳动物或细菌细胞系进行基因改造以使得含有的所需肽的基因的重组质粒引入细菌系中，从而制备蛋白质。然后在存在含有例如糖、氨基酸、生长因子、盐、来自不同动物的血清等的复合培养基的情况下在合适的条件下培养这些细胞株。随后需要将所需要蛋白质与培养基的组分、细胞代谢产物和其它污染物分离，直至获得足以用作治疗剂的纯度。从细胞培养基中提纯蛋白质的方法是技术人员公知的。一些蛋白质被细胞系直接释放到周围介质中，其它的保留在细胞内。后者要求首先使细胞裂解，这可以通过诸如机械剪切、渗压冲击或酶处理之类的多种方法进行。在这种情况下，均浆包括所有细胞内容物，并且需要追加的工艺过程以去除亚细胞片段。这种追加的工艺过程包括，例如，差速离心或过滤。如果蛋白质直接由上清液获得，还必须使用这些步骤去除部分死细胞或类似物。此后，通常通过多种色谱分离技术的结合来进一步提纯蛋白质。这些技术根据大小、电荷、疏水性或对特定物质的亲合力分离蛋白质混合物。对于这些技术的每一种，可以利用许多柱材料，它们根据所需的蛋白质进行使用。任何色谱法的目标是使所需的蛋白质在柱上表现出与污染物不同的迁移性能，并因此在与污染物不同的时间洗出。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种可储存形式的尽可能纯净的IL-15/Fc融合蛋白。通过一种从组合物中提纯IL-15/Fc的方法实现该目的，该方法包括下列步骤a)将该组合物施加于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一IL-15/Fc洗脱液和b)将步骤a)的洗脱液施加于阴离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液。此处使用的IL-15/Fc融合蛋白(IL-15/Fc)是包含两个融合部分，也就是IL-15组分和Fc组分的融合蛋白。在例如Capon等(US5,428,130)中描述了除功能蛋白外还包含免疫球蛋白融合部分的重组蛋白。优选由N-末端突变或未突变的IL-15部分与C-末端Fc部分构成的融合蛋白。在WO 97/41232和Kim等(1998，J.Immunol，1605742-5748)中公开了这样的蛋白质。融合蛋白的IL-15部分介导了例如与活化T细胞上表达的IL-15受体(IL-15R)的选择性结合。IL-15部分因此可以是天然生成的IL-15及其突变体。在更优选的具体实施方式中，IL-15组分是野生型IL-15。在这个连接体，IL-15可以是任何物种的IL-15，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。还包括不同的剪接变体和天然生成的变体。在此特别优选哺乳动物的核酸，特别是人类或鼠科形式的核酸。IL-15突变体包括IL-15组分，其与天然生成的IL-15相比，具有突变，例如一个或多个缺失、插入或取代或它们的组合。然而，所用IL-15变体必须能够使IL-15/Fc融合蛋白结合到IL-15R上。这可以例如在使用标记IL-15和含有IL-15受体的膜或细胞的放射配体结合测定法中检验(Carson WE等，1994，J Exp Med.，180(4)1395-1403)。在优选具体实施例方式中，突变体可以具有与IL-15(具有激动剂作用的IL-15组分)类似的作用，并且其活性与IL-15相比，可以处于相同、降低或甚至提高的水平。对于含有具有激动剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白，可用的试验系统是通过所述IL-15组分刺激鼠科CTLL-2细胞增殖。如果IL-15组分具有至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，再优选100％，再更优选150％，最优选至少200％的活性，则该组分具有按照本专利技术的激动剂作用。具有激动剂作用的IL-15组分的活性是指该IL-15组分对响应的刺激与野生型IL-15的刺激相比的百分比(野生型IL-15相当于100％活性)。在这些测定中可以单独使用IL-15组分或使用融合蛋白。对于具有激动剂作用的IL-15组分，优选使用保守性氨基酸取代，即一个残基被具有类似性质的另一个取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸组中、在含有脂族羟基侧链的氨基酸组中、在含有酸性基团的氨基酸组中、在含有酰胺衍生物的氨基酸组中，在含有碱性基团的氨基酸组中或在含有芳族基团的氨基酸之间的取代。典型的保守和半保守取代如下 在本专利技术的另一具体实施方式中，使用具有拮抗剂作用的IL-15组分。这种组分抑制了IL-15的活动或抑制了IL-15与IL-15R的结合，其可以完全或仅部分实现这种抑制。对于含有具有拮抗剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白，可用的试验体系是WO 97/41232中所述的试验体系(BAF-BO3细胞增殖测定法)。IL-15组分如果抑制了至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最优选至少95％的IL-15-介导的活动或IL-15与IL-15R的结合，该组分就具有按照本专利技术的拮抗剂作用。可以在这些测定中单独使用IL-15组分或使用融合蛋白。对于具有拮抗剂作用的IL-15组分，优选使用非保守性氨基酸取代，其中一个残基被具有不同性质的另一个取代。进一步优选在负责与IL-15-R相互作用或负责信号转导的分子区域产生的取代。在优选具体实施例方式中，所用具有拮抗剂作用的IL-15组分是WO97/41232中所述的IL-15突变体或在氨基酸位置56具有突变的IL-15组分(天冬氨酸盐；AAA21551)。最优选的是在白细胞介素-15的氨基酸位置149和/或156引入点突变的突变体，特别是用天冬氨酸盐取代谷氨酰胺(参看WO 97/41232)。在一个具体实施例方式中，还可以结合上述突变。在一个具体实施例方式中，融合蛋白的突变IL-15部分与野生型IL-15，优选与人类野生型IL-15(例如National Center for BiotechnologyInformation的数据库，接受号AAA21551)，或者其它天然生成的变体(例如National Cent本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从液体组合物中提纯ＩＬ－１５／Ｆｃ融合蛋白的方法，该方法包括：ａ）将该组合物施加于亲和色谱柱并从该柱中洗脱第一ＩＬ－１５／Ｆｃ洗脱液和ｂ）将步骤ａ）的洗脱液施加于离子交换色谱柱并从该柱中洗脱第二ＩＬ－１５／Ｆｃ洗脱液。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A埃尔曼，
申请(专利权)人：豪夫迈罗氏公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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