由野生型ＩＬ－１５片段和除鼠ＩｇＧ２ｂ片段外的ＩｇＧ Ｆｃ片段组成的融合蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由野生型IL-15和IgG Fc片段组成的融合蛋白，涉及其制备并用于抑制免疫反应以及预防和/或治疗移植后遗症和/或自身免疫性疾病。有效的免疫反应是由被激活的免疫系统T细胞启动的，该激活是由抗原或有丝分裂原诱导的。T细胞的活化需要大量的细胞变化，包括例如细胞因子及其受体的表达。在这些细胞因子中包括IL-15和IL-2。IL-15和IL-2已知为生长因子，它在人和鼠T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒T细胞(CTL)和淋巴细胞激活杀伤(LAK)细胞的增殖和分化中起显著的作用，同时在被例如抗免疫球蛋白(抗-IgM)或佛波醇酯激活的B细胞共刺激中起作用。这些细胞的增殖扩大了机体的免疫反应。IL-15第一次被描述为诱导IL-2依赖的鼠细胞毒T细胞(CTLL-2)增殖的分泌性细胞因子。IL-15的特征是前体蛋白长度162个氨基酸并具有48个氨基酸前导序列，其成熟蛋白长度为114个氨基酸(Grabstein等人，(1994)Science 264(5161)965-8)。IL-15在上皮和成纤维细胞系以及外周血单核细胞中形成。其特异性mRNA也在胎盘、骨骼肌和肾中被发现(Grabstein等人，见上)。除生物学特性相同以外，IL-15和IL-2也具有类似的结构。两个分子均与T细胞膜上至少3个独立的受体亚单位结合，通过β和γ亚单位复合物发生的信号传导是相同的，而α亚单位对IL-15或IL-2的结合是特异的。已经发现，直接抗IL-2受体α亚单位的抗体对IL-15与其特异性α亚单位的结合没有任何影响(Grabstein等人，见上)，而直接抗IL-2受体β亚单位的抗体阻断IL-15的活性(Giri等人，(1994)EMBO J.，132822)。通过IL-15β和γ亚单位发生信号传导。在很多疾病中，为了治疗有必要抑制患者免疫系统的反应。这些疾病包括，例如自身免疫性疾病特别是I型糖尿病(Botazzo，G.F.等人，(1985)N Engl J Med 113353)、风湿性关节炎、多发性硬化、慢性肝病、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病和移植物排斥(Sakai等人，(1998)Gastroenterology，114(6)1237-1243；Kivisakk等人，(1998)Clin Exp Immunol，111(1)193197)。假如免疫活性细胞从遗传学不同的机体中移出，那么这些细胞就与受体进行反应(GVHD)(Janeway C.A.和Travers P.，Spektrum-Verlag，德文版，1995，467页)。器官或组织移植已经成为许多威胁生命疾病情况下的标准方法，在许多情况下已成为唯一的挽救生命治疗。但是，关于受体中的排斥反应存在着困难，这些反应被针对移植物外源细胞表面抗原的免疫应答激发。与移植相关的移植物排斥程度依赖于供体和受体间组织原差异的大小(组织相容性)。供体和受体间存在的抗原型的差异引起后来的免疫反应，导致了直接抗移植物的排斥反应。体液和细胞反应的结果是移植物被排斥。体液效应器是不同特异性的抗体，如抗体依赖的细胞介导细胞毒，和直接抗供体HLA系统中结构的抗体。在细胞效应器中特别是细胞毒T细胞联合巨噬细胞(Immunologie，JanewayC.A.和Travers P.，Spektrum-Verlag，德文版，1995，522-8页)。一个治疗方法是应用免疫抑制剂，特别是拮抗性IL-15或IL-2抗体，或IL-15或IL-2拮抗剂，来抑制体液或细胞免疫应答。采用直接抗IL-15或IL-2分子抗体的各种治疗已被叙述。因此，例如，通过给予抗IL-2β的单克隆抗体(Mik.β-1)有可能延长同种异体移植的灵长类心脏的存活期(Tinubu等人，(1994)JImmunol.1534330)。采用直接抗T细胞特异性抗原CD3的单克隆抗体以阻断移植物排斥也有叙述(Mackie等人，(1990)TransPlantation491150)。此外，许多改变IL-15与其受体结合行为的IL-15拮抗剂已有叙述。通过在野生型IL-15序列中导入突变而获得这些拮抗剂。因此，例如，叙述了56位氨基酸(天门冬氨酸)的突变(WO 96/26274)，导致与IL-15受体α亚单位结合但阻止与β亚单位的结合。在另一个方法中，156位氨基酸(谷氨酰胺)的突变抑制与γ亚单位的相互作用(WO 96/26274；WO 97/41232)。进而，因空间原因，当PEG化的IL-15允许与α亚单位结合时就不再可能与β亚单位结合(Pettit等人，(1997)J BiolChem，27242312-2318)。上面叙述的IL-15拮抗剂是突变的IL-15(mut-IL-15)序列，对其自身或作为融合蛋白产生拮抗效果。这些融合蛋白是由N末端mut-IL-15片段和C末端Fc片段，特别是鼠IgG2a或人IgG1，组成的多肽(WO 97/41232；Kim等人，(1998)J Immunol.，1605742-5748)。Fc(可结晶片段)片段被理解为不结合任何抗原的抗体片段。抗体的其它两个相同的Fab(抗原结合片段)片段具有抗原结合活性(Immunologie，Janeway C.A.和Travers P.，德文版(1995)，117ff页)。但是，这些突变的IL-15分子的缺点是，同野生型IL-15相比，它们具有改变的一级、二级和三级结构，因而具有不同的降解点，导致在细胞中出现天然不存在的降解产物，可能在机体中显示毒性作用。这些和其它副作用的性质和程度是不能详细预见的。另一个缺点是，携带移植物的患者通常终生保留这些移植物，这意味着他们需要在其整个生存期内摄取免疫抑制剂。特别地，由于我们对长期摄取这些免疫抑制剂的副作用的认识不充分，迫切需要去除这些副作用或至少限制它们。已经显示，当给予免疫抑制成分如环孢霉素A、FK506和雷帕霉素时，这些物质抑制所有T细胞的增殖(Penn，(1991)TransplantProc，231101；Beveridge等人，(1984)Lancet 1788)。严重的缺点是，通常的全身给予这些免疫抑制剂导致其后在整个机体的分布，而不能保证在移植的细胞、组织或器官局部存在。但是，整个机体T细胞增殖的抑制可以引起感染、毒性分解产物或甚而癌症。因此，本专利技术的目的是生产在免疫应答被抑制的机体内不显示、或很少显示任何副作用的免疫抑制剂。已知，突变的IL-15分子或含有mut-IL-15和Fc片段的融合蛋白，通过抑制或改变受体结合行为而对IL-15具有拮抗作用。尽管本身可能期待拮抗作用，但是，含有N末端野生型IL-15和C末端Fc片段，特别是鼠IgG2a，的融合蛋白也显示拮抗作用还是完全令人吃惊的。仅仅通过在天然存在的通常免疫刺激性的IL-15分子上附着Fc片段，就可能逆转作用机制并获得免疫应答的抑制。此发现令人吃惊地准确，因为假定融合蛋白的野生型IL-15片段自然地折叠，不可能设想附着的Fc片段本身能够改变受体结合行为而使整个野生型IL-15-Fc分子显示对野生型IL-15的拮抗作用。因此，本专利技术的部分主题涉及融合蛋白，它一方面由野生型IL-15组成，另一方面包括IgG Fc片段，除鼠Ig本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：I·德雷埃尔，T·默尔，
申请(专利权)人：豪夫迈罗氏公司，
类型：发明
国别省市：
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