寡核苷酸的制备方法技术

一种合成寡核苷酸的方法，其中在活化剂存在下使用亚磷酰胺方法在可溶胀固体载体上装配寡核苷酸，其中所述活化剂不为四唑或取代的四唑。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备寡核苷酸的方法。寡核苷酸通常通过固相合成制备，其中新生的寡核苷酸偶联在载体上。通常，在四唑或取代四唑活化剂存在时使用亚磷酰胺化学来影响核苷的依次偶联。大多数合成应用中所用到的载体是刚性的、非溶胀的载体，具体为可控多孔玻璃和刚性聚苯乙烯。已经进行了许多使用可溶胀载体的尝试，可溶胀载体具有潜在负荷更高的优点。它们也使用基于四唑的常规活化剂。一般而言，结果是令人失望的，不是偶联反应缓慢就是需要大量的活化剂。令人惊讶地是，如今已经找到了一类特殊的活化剂，能显著地改善使用亚磷酰胺化学和可溶胀载体的寡核苷酸合成。本专利技术提供了合成寡核苷酸的方去，其中在活化剂存在下使用亚磷酰胺方法在可溶胀的载体上装配寡核苷酸，其中活化剂不为四唑或取代的四唑。本专利技术的方法中所使用的活化剂包括杂芳环中含有少于4个氮原子的杂芳化合物的盐，尤其是含有5或6元环的杂芳化合物，其中环上含有1或2个氮原子。实例包括公开于PCT申请WO99/62922中(通过引用结合到本文中)的吡啶鎓、咪唑啉鎓和苯并咪唑啉鎓盐，具体为六氟磷酸盐、四氟硼酸盐、三氟甲磺酸盐、氢氯酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、甲磺酸盐、O-甲苯磺酸盐、溴化物或三氟磺酸盐(trifluorosulphonyl)；苯并三唑及其衍生物，尤其是羟基苯并三唑；糖精或其衍生物，优选作为与有机碱形成的盐-络合物使用，尤其是糖精的N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶盐。优选使用的糖精或糖精衍生物具有通式 式(I)式1中，p为0或1-4的整数。每次出现的R为取代基，优选各自独立，为卤素、取代或未取代的脂族基、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、氰基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、-CHO、-COR3、-NHCOR3、取代或未取代的芳烷基、卤代烷基(如三氟甲基和三氯甲基)或-SR3。R优选为卤素、取代或未取代的脂族基、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3或氰基。或者，两个相邻的R基团与它们连接的碳原子一起形成6元的饱和或不饱和环。形成的6元环优选为芳环。R1和R2各自独立为-H、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基；或与它们连接的氮一起形成杂环基。R3为取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳烷基。X为O或S。X优选为O。特别优选X为O且p为0。可存在的合适取代基包括芳基、卤代芳基、烷基、卤代烷基(如三氟甲基或三氯甲基)、脂族醚、芳族醚、苄基、取代苄基、卤素尤其是氯和氟、氰基、硝基、-S-(脂族或取代的脂族基)和-S-(芳族或取代的芳族)基团。优选糖精或糖精衍生物作为与有机碱形成的盐络合物使用。能与糖精或糖精衍生物形成盐-络合物的有机碱，是在pH7时趋向于接受质子的有机化合物。优选的有机碱为仲胺、叔胺或氮杂杂环碱，它们各自可以被一个或多个取代基取代或未取代。非质子有机碱为在没有接受质子之前其化学结构中没有任何氢键质子的有机碱。如本文所描述的，非质子有机碱如叔胺和非质子氮杂杂环化合物优选与式1化合物联合使用。本文所用的氮杂杂环包括芳环中有一个或多个氮原子的杂芳基和非芳环体系中至少有一个氮原子的杂脂环基。氮杂杂芳碱优选具有5元或6元芳环，芳环上有1-3个氮原子。氮杂杂脂环化合物优选为5元或6元环，环上通常含有1个或2个氮原子。氮杂杂环碱的实例包括嘧啶、1-烷基吡唑(尤其是1-(C1-4烷基)吡唑)、1-芳基吡唑、1-苄基吡唑、吡嗪、N-烷基嘌呤(尤其是N-(C1-4烷基)嘌呤)、N-芳基嘌呤、N-苄基嘌呤、N-烷基吡咯(尤其是N-(C1-4烷基)吡咯)、N-芳基吡咯、N-苄基吡咯、吡啶、N-烷基咪唑(尤其是N-(C1-4烷基)咪唑)、N-芳基咪唑(尤其是N-苯基咪唑)、N-苄基咪唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、N-烷基吲哚(尤其是N-(C1-4烷基)吲哚)、N-芳基吲哚、N-苄基吲哚、N-烷基苯并咪唑(尤其是N-(C1-4烷基)苯并咪唑)、N-芳基苯并咪唑、N-苄基苯并咪唑、三嗪、噻唑、1-烷基-7-氮杂吲哚(尤其是1-(C1-4烷基)-7-氮杂吲哚)、1-芳基-7-氮杂吲哚、1-苄基-7-氮杂吲哚、吡咯烷、吗啉、哌啶和哌嗪。尤其优选氮杂杂环碱为吡啶类如吡啶和3-甲基吡啶、以及N-(C1-4烷基)咪唑如N-甲基咪唑。叔胺为具有与三个碳原子结合的氮原子的有机碱，该氮原子经常结合三个芳基(通常为苯基)和/或烷基，通常为三个烷基，包括例如三烷基胺如三甲胺、三乙胺和二异丙基乙胺。此外，叔胺可以为氮杂杂环基，其中氮原子为非质子的。优选叔胺为氮杂杂环基。氮杂杂环叔胺的实例为N-烷基吡咯烷、N-芳基吡咯烷、N-烷基吡咯、N-芳基吡咯、N-烷基吗啉、N-芳基吗啉、N-烷基哌啶、N-芳基哌啶、N-二烷基哌嗪、N，N-二芳基哌嗪、N-烷基-N-芳基-哌嗪、奎宁环、1，5-二氮杂二环壬-5-烯和1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯。叔胺也可以是氮杂杂芳基或氮杂杂脂环基化合物。仲胺为含有与一个氢原子和两个碳原子结合的氮原子的有机碱。通常该氮原子结合两个烷基或芳基或形成氮杂杂环基团的部分。仲胺化合物的实例包括二乙胺和二异丙胺。特别优选的有机碱包括吡啶、3-甲基吡啶和N-甲基咪唑。本专利技术方法中可使用的可溶胀载体为当接触合适的溶剂时体积增加的载体。应该认识到，溶胀的程度在载体和载体之间不同，且依赖于溶剂的性质。优选可溶胀固体载体的溶胀比范围在5-20之间。溶胀比定义为 Vol最终＝使载体在给定溶剂中完全溶胀后的最终体积。Vol最初＝载体的最初干燥柱床体积。可溶胀载体典型地为交联聚合物，其中交联的数量低到足够允许溶胀。这些聚合物中的交联度可以表达为百分率，对应为来自含有两个或更多可聚合双键的单体的可聚合双键摩尔数占可聚合双键摩尔数总量的百分数。交联百分率常常在0.1、通常0.5至20％的范围内，如从1-10％，优选为不超过5％。含有交联不超过20％的聚合物通常是可溶胀的，而含有交联大于20％的聚合物通常是不可溶胀的。所使用的最优选的交联水平从1％-5％，尤其从1％-3％。聚合物载体可以来源于包含一种或多种单体的组合物的聚合，优选来源于包含两种或更多单体的组合物的聚合。单体可包含一个或多个可聚合双键。优选聚合物载体来源于以下组合物的聚合该组合物包含一种或多种只含有一个可聚合双键的单体和一种或多种含有两个或更多个可聚合双键的单体。最优选聚合物载体来源于以下组合物的聚合该组合物包含一种或两种只含有一个可聚合双键的单体和一种含有两个或三个可聚合双键的单体。只包含一个可聚合双键的单体实例包括苯乙烯和取代的苯乙烯如α-甲基苯乙烯、甲基苯乙烯、叔丁基苯乙烯、溴代苯乙烯和乙酰氧基苯乙烯；单烯不饱和二羧酸的烷基酯如马来酸二正丁酯和延胡索酸二正丁酯；羧酸的乙烯酯如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和叔碳酸乙烯酯如VeoVa9和VeoVa10(VeoVa为Shell的商标)；丙烯酰胺如甲基丙烯酰胺和乙基丙烯酰胺；异丁烯酰胺如甲基异丁烯酰胺和乙基异丁烯酰胺；腈单体如丙烯腈和甲基丙烯腈；丙烯酸和异丁烯酸酯，优选任选取代的丙烯酸和异丁烯酸的C1-20烷基酯和C1-20环烷基酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸-2-乙基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：P·麦科尔马克，
申请(专利权)人：艾夫西亚生物科技公司，
类型：发明
国别省市：