一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法技术

本发明专利技术公开了一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，包括以下步骤：准备材料、RNA提取与纯化、CcPILS基因RACE、生物信息学分析和时空表达分析。本发明专利技术利用RACE方法，克隆出山核桃PIL同源基因CcPILS，该基因全长序列1541bp，其中开放阅读框序列1263bp，应用生物信息学软件分析，预测该序列编码420个氨基酸，CcPILS蛋白分子量约为46.22KD，PI为5.38，定位在内质网膜，N、C两端各有5个跨膜疏水结构域，被中间的亲水环所分隔，该基因与拟南芥AtPILS5、AtPILS7具有较高同源性，属于PILS基因家族中的Clade III亚族，荧光定量RT‑PCR分析表明，在山核桃嫁接前后，CcPILS在接穗中表达趋势和在砧木中的表达一致，对山核桃嫁接难、品种选育困难、品质难以提高等问题的解决提供了有利的促进作用。

Cloning and expression analysis of CcPILS gene of growth hormone carrier protein of Carya

The invention discloses a hickory auxin efflux carrier protein CcPILS gene cloning and expression analysis method, which comprises the following steps: preparing materials, RNA extraction and purification, CcPILS RACE gene, bioinformatics analysis and expression analysis. The invention uses RACE method, cloning of PIL homologous gene CcPILS from walnut, the full-length cDNA sequence of 1541bp, the open reading frame sequence analysis software 1263bp, the application of bioinformatics prediction, the sequence encoding 420 amino acids, CcPILS protein molecular weight is about 46.22KD, PI 5.38, located in the endoplasmic reticulum, N and C at each end there are 5 hydrophobic transmembrane domains, separated by a hydrophilic intermediate ring, the gene of Arabidopsis AtPILS5 and AtPILS7 have higher homology, Clade belongs to the III subfamily of PILS gene family, RT fluorescence quantitative PCR analysis showed that before and after the Walnut Grafting, consistent expression of CcPILS in scion and trend in the rootstock, on Carya cathayensis grafting breeding is difficult, difficult, difficult to improve the quality of the solution provides a favorable role in promoting.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及山核桃的
，特别涉及一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法。
技术介绍
植物通过生长素代谢和胞间运输调节不同组织间生长素含量，进而产生信号调控植物向性生长、侧生器官的发生与发育等。极性运输是生长素的重要特征，极性运输由生长素输入载体AUX/LAX蛋白家族(AUXINRESISTANT1/LI-KEAUX1)和输出载体PIN-FORMED(PIN)蛋白家族协同完成。Barbez等人发现了另外一个具有7个成员的生长素的胞内运输相关基因家族。该基因虽然与PIN的序列相似度非常低(10％～18％)，但拓扑结构与PIN蛋白相似，因此被命名为PILS(PIN-LIKES，PILS)。PILS可以分为CladeI、CladeII和CladeIII三个亚家族，其中CladeIII亚族包含PILS5和PILS7，在导管植物进化中过程中具有重要作用。山核桃(CaryacathayensisSarg.)属于胡桃科山核桃属植物，雌雄同株异花。山核桃是重要的木本油料植物，也是浙江省重要的经济林树种，经济价值大，对提高山区农民收入有重要意义。但山核桃嫁接难，品种选育困难，品质难以提高。为克服以上难题，围绕山核桃嫁接成活的生理生化机理，有必要提出山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆方法，并对CcPILS表达调控进行分析，为山核桃CcPILS基因功能及山核桃嫁接过程中生长素调控机理的研究提供有利的帮助，促进对山核桃嫁接难、品种选育困难、品质难以提高问题的解决。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，其旨在解决现有技术中山核桃嫁接难、品种选育困难、品质难以提高的技术问题。为实现上述目的，本专利技术提出了一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，包括以下步骤：A)、准备材料：植物材料为山核桃嫁接样品，在试验地点于嫁接前后开始取样，嫁接前分别取砧木和接穗作为对照，然后于嫁接后每隔3d、7d、14d在嫁接部位采集嫁接苗，每次采集30～50个嫁接苗，带回实验室于-70℃保存备用；B)、RNA提取与纯化：对步骤A)中取样的砧木、接穗和嫁接苗，均采用改良的CTAB法提取总RNA，然后采用OligotexmRNASpin-Column试剂盒按照说明书操作纯化mRNA；C)、CcPILS基因RACE：c1)参考RACE试剂盒说明书上引物设计原则，对山核桃花芽转录组数据中获得的生长素输出载体蛋白同源基因序列片段设计5’RACE特异性引物symRev和newpilsR，并分别与GSP和NGSP1先后用于5’RACE巢式PCR；c2)根据已知片段的序列设计3’RACE特异性引物newpilsF和SymFor，并分别与GSP2和NGSP2先后用于3’RACE巢式PCR；c3)将5’RACE和3’RACEPCR扩增所得的产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检后进行切胶回收，回收产物通过rTaq酶加A尾后与pMD-18载体连接，再转化到DH5α感受态菌株中，将转化后的菌株涂布在LB平板上于37℃培养过夜，挑取单克隆，菌落PCR扩增、电泳检测后选择阳性克隆送公司测序；c4)根据测序结果设计特异性引物Pilsfor和Pilsrev，以cDNA为模版扩增CcPILS开放阅读框(ORF)，并连接到pMD-18后测定序列；D)、生物信息学分析：将所测定的序列翻译成氨基酸序列，利用Mega6.0将该氨基酸序列与AtPILS1、AtPILS2、AtPILS3、AtPILS4、AtPILS5、AtPILS6、AtPILS7、DcPILS3、DcPILS6、DcPILS7、MdPILS3、MdPILS5、MdPILS6构建系统发育树，利用工具和程序进行生物信息学分析；E)、时空表达分析：选择一株20年生的山核桃，采取幼根、直径1cm茎、幼叶、叶芽、雄花序和果实，以及选取山核桃嫁接前后不同时期砧木和接穗，提取总RNA，并进行cDNA的合成，采用TAKARA的SYBRPremixExTaqTM(perfectrealtime)试剂盒进行定量RT-PCR分析，具体方法参照操作说明书，根据已经获得的生长素输出载体蛋白CcPILS蛋白基因和内参actin基因序列分别设计定量RT-PCR正反向引物SymFor、symRev、actinFor和actinRev，并分别进行PCR反应，导出数据，进行熔解曲线分析，检测每份样品的水通道蛋白和actin基因CT值，每份样品重复3次PCR，根据2-△△CT计算平均值和标准差，试验所得数据用MicrosoftExcel2010作图，进行时空表达分析。作为优选，所述的步骤c1)中5’RACE特异性引物symRev序列为5’-TAGCTCCTCCCGAATCTGCTGAAG-3’，newpilsR序列为5’-TCCCGAATCTGCTGAAGAAATCCA-3’。作为优选，所述的步骤c1)中5’RACE巢式PCR分为两轮，第一轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物symRev和下游引物GSP1各1μl，模版5’-RACE-ReadycDNA1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌蒸馏水32.5μl，PCR扩增程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，共30个循环；第二轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物newpilsR和下游引物NGSP1各1μl，模版为第一轮PCR扩增产物1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌蒸馏水32.5μl，PCR扩增程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，共30个循环。作为优选，所述的步骤c2)中3’RACE特异性引物newpilsF序列为5’-ATCTCCTCCTTATCATCGTCCCCG-3’，SymFor序列为5’-AGCACTTCAAGCAACTGAGGAGGT-3’。作为优选，所述的步骤c2)中3’RACE巢式PCR分为两轮，第一轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物newpilsF和下游引物GSP2各1μl，模版3’-RACE-ReadycDNA1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌蒸馏水32.5μl，PCR扩增程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，共30个循环；第二轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物SymFor和下游引物NGSP2各1μl，模版为第一轮PCR扩增产物1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，其特征在于：包括以下步骤：A)、准备材料：植物材料为山核桃嫁接样品，在试验地点于嫁接前后开始取样，嫁接前分别取砧木和接穗作为对照，然后于嫁接后每隔3d、7d、14d在嫁接部位采集嫁接苗，每次采集30～50个嫁接苗，带回实验室于‑70℃保存备用；B)、RNA提取与纯化：对步骤A)中取样的砧木、接穗和嫁接苗，均采用改良的CTAB法提取总RNA，然后采用Oligotex mRNA Spin‑Column试剂盒按照说明书操作纯化mRNA；C)、CcPILS基因RACE：c1)参考RACE试剂盒说明书上引物设计原则，对山核桃花芽转录组数据中获得的生长素输出载体蛋白同源基因序列片段设计5’RACE特异性引物symRev和newpilsR，并分别与GSP和NGSP1先后用于5’RACE巢式PCR；c2)根据已知片段的序列设计3’RACE特异性引物newpilsF和SymFor，并分别与GSP2和NGSP2先后用于3’RACE巢式PCR；c3)将5’RACE和3’RACE PCR扩增所得的产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检后进行切胶回收，回收产物通过rTaq酶加A尾后与pMD‑18载体连接，再转化到DH5α感受态菌株中，将转化后的菌株涂布在LB平板上于37℃培养过夜，挑取单克隆，菌落PCR扩增、电泳检测后选择阳性克隆送公司测序；c4)根据测序结果设计特异性引物Pilsfor和Pilsrev，以cDNA为模版扩增CcPILS开放阅读框(ORF)，并连接到pMD‑18后测定序列；D)、生物信息学分析：将所测定的序列翻译成氨基酸序列，利用Mega6.0将该氨基酸序列与AtPILS1、AtPILS2、AtPILS3、AtPILS4、AtPILS5、AtPILS6、AtPILS7、DcPILS3、DcPILS6、DcPILS7、MdPILS3、MdPILS5、MdPILS6构建系统发育树，利用工具和程序进行生物信息学分析；E)、时空表达分析：选择一株20年生的山核桃，采取幼根、直径1cm茎、幼叶、叶芽、雄花序和果实，以及选取山核桃嫁接前后不同时期砧木和接穗，提取总RNA，并进行cDNA的合成，采用TAKARA的SYBR Premix ExTaqTM(perfect real time)试剂盒进行定量RT‑PCR分析，具体方法参照操作说明书，根据已经获得的生长素输出载体蛋白CcPILS蛋白基因和内参actin基因序列分别设计定量RT‑PCR正反向引物SymFor、symRev、actin For和actin Rev，并分别进行PCR反应，导出数据，进行熔解曲线分析，检测每份样品的水通道蛋白和actin基因CT值，每份样品重复3次PCR，根据2‑△△CT计算平均值和标准差，试验所得数据用Microsoft Excel 2010作图，进行时空表达分析。...

【技术特征摘要】
1.一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，其特征在于：包括以下步骤：A)、准备材料：植物材料为山核桃嫁接样品，在试验地点于嫁接前后开始取样，嫁接前分别取砧木和接穗作为对照，然后于嫁接后每隔3d、7d、14d在嫁接部位采集嫁接苗，每次采集30～50个嫁接苗，带回实验室于-70℃保存备用；B)、RNA提取与纯化：对步骤A)中取样的砧木、接穗和嫁接苗，均采用改良的CTAB法提取总RNA，然后采用OligotexmRNASpin-Column试剂盒按照说明书操作纯化mRNA；C)、CcPILS基因RACE：c1)参考RACE试剂盒说明书上引物设计原则，对山核桃花芽转录组数据中获得的生长素输出载体蛋白同源基因序列片段设计5’RACE特异性引物symRev和newpilsR，并分别与GSP和NGSP1先后用于5’RACE巢式PCR；c2)根据已知片段的序列设计3’RACE特异性引物newpilsF和SymFor，并分别与GSP2和NGSP2先后用于3’RACE巢式PCR；c3)将5’RACE和3’RACEPCR扩增所得的产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检后进行切胶回收，回收产物通过rTaq酶加A尾后与pMD-18载体连接，再转化到DH5α感受态菌株中，将转化后的菌株涂布在LB平板上于37℃培养过夜，挑取单克隆，菌落PCR扩增、电泳检测后选择阳性克隆送公司测序；c4)根据测序结果设计特异性引物Pilsfor和Pilsrev，以cDNA为模版扩增CcPILS开放阅读框(ORF)，并连接到pMD-18后测定序列；D)、生物信息学分析：将所测定的序列翻译成氨基酸序列，利用Mega6.0将该氨基酸序列与AtPILS1、AtPILS2、AtPILS3、AtPILS4、AtPILS5、AtPILS6、AtPILS7、DcPILS3、DcPILS6、DcPILS7、MdPILS3、MdPILS5、MdPILS6构建系统发育树，利用工具和程序进行生物信息学分析；E)、时空表达分析：选择一株20年生的山核桃，采取幼根、直径1cm茎、幼叶、叶芽、雄花序和果实，以及选取山核桃嫁接前后不同时期砧木和接穗，提取总RNA，并进行cDNA的合成，采用TAKARA的SYBRPremixExTaqTM(perfectrealtime)试剂盒进行定量RT-PCR分析，具体方法参照操作说明书，根据已经获得的生长素输出载体蛋白CcPILS蛋白基因和内参actin基因序列分别设计定量RT-PCR正反向引物SymFor、symRev、actinFor和actinRev，并分别进行PCR反应，导出数据，进行熔解曲线分析，检测每份样品的水通道蛋白和actin基因CT值，每份样品重复3次PCR，根据2-△△CT计算平均值和标准差，试验所得数据用MicrosoftExcel2010作图，进行时空表达分析。2.如权利要求1所述的一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，其特征在于：所述的步骤c1)中5’RACE特异性引物symRev序列为5’-TAGCTCCTCCCGAATCTGCTGAAG-3’，newpilsR序列为5’-TCCCGAATCTGCTGAAGAAATCCA-3’。3.如权利要求1所述的一种山核桃生长素输出载体蛋白CcPILS基因克隆及表达分析方法，其特征在于：所述的步骤c1)中5’RACE巢式PCR分为两轮，第一轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物symRev和下游引物GSP1各1μl，模版5’-RACE-ReadycDNA1μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌蒸馏水32.5μl，PCR扩增程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，共30个循环；第二轮PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture(2.5mMeach)4μl，上游引物newpilsR和下游引物NGSP1各1μl，模版为第一轮...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炳松，高柳肖，郭文彬，闫道良，袁虎威，赵亮，徐栋斌，童亚菲，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33