拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法技术

本发明专利技术公开一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，包括以下步骤：(1)采用甲醇提取和加入内标的方法对待测豆制品进行预处理；(2)采用高效液相色谱‑串联质谱方法将预处理后的待测豆制品中的雌马酚对映异构体进行分离和检测，其中，高效液相色谱条件为：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相由A相和B相组成，A相为乙酸铵水溶液，B相为甲醇。本发明专利技术利用高效液相色谱‑串联质谱开发了一种拆分雌马酚对映异构体的方法，通过优化液相色谱参数，确定了较佳的分析条件，从而简化了提取过程，通过加入内标的方式避免了基质效应的影响；该方法可有效避免假阳性结果的出现，能够实现豆制品中S‑雌马酚的快速测定。

Separation of equol enantiomers and determination of content in soybean products in the

The invention discloses a separation of equol enantiomers and determination of content in soybean products in its, which comprises the following steps: (1) using methanol extraction and adding internal standard method to measure Soybean Pretreatment; (2) by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method after pretreatment to measure equol in soybean products enantiomers were separated and detected, the HPLC column is the polysaccharide derivative RP coated chiral chromatographic column; the mobile phase composed of A phase and B phase, A phase of ammonium acetate aqueous solution, B phase of methanol. The use of chromatography tandem mass spectrometry has developed a method of separation of equol enantiomers of the present high performance liquid, by optimizing the parameters of liquid chromatography, the optimum analysis conditions, which simplifies the extraction process, by adding internal standard way to avoid the matrix effect; the method can effectively to avoid false positive results, can realize the rapid determination of bean products S equol.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学分析检测领域，具体涉及一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法。
技术介绍
雌马酚(Equol)，化学名称为7-羟基-3-(4-羟苯基)-苯并二氢呋喃，化学结构式如下，是大豆异黄酮在人体肠道中由某些细菌代谢下产生的最终代谢产物之一。近年来研究发现，雌马酚是大豆异黄酮生理功能的主要体现者，在与雌激素调节相关的疾病如乳腺癌、前列腺癌、更年期综合症、以及心血管疾病、骨质疏松症等方面具有预防和治疗作用。但又发现仅有30％-50％的人类个体能在其肠道微生物菌群作用下将大豆异黄酮代谢为雌马酚，因此，外源性补充雌马酚就显得尤为重要。雌马酚为手性化合物，有两种对映异构体，分别为R-雌马酚与S-雌马酚，由于其与雌激素受体亲和程度不同，因此二者具有不同的生物学特性，而人体代谢产生的均为S-雌马酚。因此，开发手性拆分雌马酚对映体的技术并建立食品中S-雌马酚的含量测定方法具有十分重要的意义。雌马酚化学结构式食品中的雌马酚通常由大豆异黄酮生物发酵代谢而来，大豆异黄酮是一类黄酮化合物，主要存在于大豆和豆制品中，目前已知可能含有雌马酚的食品为发酵型豆制品，臭豆腐与腐乳是常见的发酵型豆制品。已有研究发现，台湾地区台北市138份臭豆腐中91％的样品检出了S-雌马酚，但测定时仅依据高效液相色谱法(HPLC)法对雌马酚进行定性检测，其准确度有待进一步确证。其他雌马酚的测定方法有：酶标记免疫吸附测定法、气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法。其中酶标记免疫吸附测定法、气相色谱法都无法检测单个对映异构体，而高效液相色谱法对于样品前处理要求较高，步骤繁琐，且可能存在假阳性的干扰。
技术实现思路
根据现有技术中的不足，本专利技术利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)开发了一种拆分雌马酚对映异构体的技术，通过优化液相色谱与质谱参数，确定了最佳分析条件，简化了提取过程，通过加入内标的方式避免了基质效应的影响，可实现腐乳与臭豆腐等发酵型豆制品中S-雌马酚的快速测定，该方法的建立可为安全膳食补充雌马酚及提升豆制品的质量提供技术支持。本专利技术采用的技术方案如下：一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，包括以下步骤：(1)采用甲醇提取和加入内标的方法对待测豆制品进行预处理；(2)采用高效液相色谱-串联质谱方法将预处理后的待测豆制品中的雌马酚对映异构体进行分离和检测，其中，高效液相色谱条件为：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为乙酸铵水溶液，B相为甲醇。优选的，步骤(1)中，所述待测豆制品为发酵型豆制品，例如腐乳、臭豆腐等。优选的，步骤(1)中，从分离和检测效果来讲，所述内标为氯霉素。优选的，步骤(1)中，根据特定的待测样品的特性，本专利技术的样品预处理的方法为：将待测豆制品、氯霉素和甲醇进行混合均质，超声萃取，离心取上清液。进一步优选的，所述待测豆制品与甲醇的添加比例为10g：(10～15)mL；进一步优选的，所述氯霉素在待测豆制品和氯霉素混合物的浓度为0.35～0.45μg/g，较佳的为0.40μg/g。进一步优选的，所述均质时间为1～3min，较佳的为2min。进一步优选的，所述超声萃取时间为1～3min，较佳的为2min。进一步优选的，所述离心条件为：转速为7000～8000rpm，离心时间为8～12min，较佳的为：转速为8000rpm，离心时间为10min。更进一步优选的，所述样品预处理的具体方法如下：准确称取待测豆制品固形物10.0g于试管中，加入适量氯霉素-D5内标，使其浓度为0.40μg/g，加入色谱甲醇10mL后，均质2min，超声萃取2min，再以8000rpm速度离心10min，取上清液0.5mL用色谱甲醇稀释至1.0mL，装入进样瓶，待测。本专利技术的待测豆制品通过甲醇提取，操作步骤简单，时间较短；加入氯霉素内标避免了基质效应的影响，使得分离和检测结果准确、可靠。优选的，步骤(2)中，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱采用CHIRALCEL OJ-RH手性柱；所述CHIRALCEL OJ-RH手性柱优选的型号为：粒径为5μm，柱内径为4.6mm，柱长为150mm。步骤(2)中，为了得到更高的灵敏度，增强质谱的离子化效率，所述乙酸铵水溶液中的乙酸铵的含量为8～12mmol/L，较佳的为10mmol/L。步骤(2)中，采用等度洗脱方式进行洗脱，A相：B相的体积比为70～80：30～20，优选A：B＝80:20；优选流速为0.8～1.2mL/min，更优选为1.0mL/min；优选柱温为20～40℃，更优选为40℃，此温度下，雌马酚分离良好，保留时间缩短，峰面积较大；优选进样量为5μL。步骤(2)中，质谱检测参数主要包括干燥气温度、碎裂电压与碰撞能量等，这些参数可以使样品母离子获得最大传输效率和子离子在质谱中有较高的响应强度，提高检测方法的灵敏度直接影响着检测灵敏度与准确度。优选的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式检测。干燥气：高纯N2，干燥气温度：300～400℃，干燥气流速：8～12L/min，雾化压力：25～35psi，毛细管电压：3500～4500V。采用多反应监测(MRM)模式。进一步优选的，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：30psi，毛细管电压：4000V。通过对雌马酚标准溶液的扫描检测，得到m/z 241[M-H]-为母离子，并对碎裂电压(Fragmentor)、碰撞能量、干燥气体温度等进行了优化，氯霉素定量时的破碎电压为120V，碰撞能量为15V，氯霉素定性时的破碎电压为120V，碰撞能量为35V，R-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为6V，R-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为9V，S-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为6V，S-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为9V，最终确定质谱参数见表1。上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：(1)本专利技术利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)开发了一种拆分雌马酚对映异构体的方法，通过优化液相色谱参数，确定了较佳的分析条件，从而简化了提取过程，通过加入内标的方式避免了基质效应的影响；该方法可有效避免假阳性结果的出现，能够实现豆制品中S-雌马酚的快速测定，该方法的建立可为安全膳食补充雌马酚及提升豆制品的质量提供技术支持。(2)本专利技术对色谱柱进行了研究，试验结果发现CHIRALCEL OJ-RH手性柱可以有效拆分雌马酚异构体，分离效果好且有良好的色谱峰形，较Nucleodexβ-PM等其他手性色谱柱分离优异。(3)本专利技术对流动相进行了研究，为了得到更高的灵敏度，增强质谱的离子化效率，本专利技术的流动相的A相选择乙酸铵水溶液，B相选择甲醇，使用该流动相，色谱峰形对称，灵敏度高，可以有效拆分雌马酚对异构体，保留时间较长，分离度较高，可满足准确测定单个对映体的要求。(4)通过本专利技术的拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，检测灵敏度较高，检出限和定量限均较低。(5)通过本专利技术的拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，具有良好的回收率和精密度，雌马酚对映异构体的回收率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)采用甲醇提取和加入内标的方法对待测豆制品进行预处理；(2)采用高效液相色谱‑串联质谱方法将预处理后的待测豆制品中的雌马酚对映异构体进行分离和检测，其中，高效液相色谱条件为：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相由A相和B相组成，A相为乙酸铵水溶液，B相为甲醇。

【技术特征摘要】
1.一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)采用甲醇提取和加入内标的方法对待测豆制品进行预处理；(2)采用高效液相色谱-串联质谱方法将预处理后的待测豆制品中的雌马酚对映异构体进行分离和检测，其中，高效液相色谱条件为：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相由A相和B相组成，A相为乙酸铵水溶液，B相为甲醇。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，所述待测豆制品为发酵型豆制品；所述内标为氯霉素。3.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，所述预处理的方法为：将待测豆制品、内标和甲醇进行混合均质，超声萃取，离心取上清液。4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，所述待测豆制品与甲醇的添加比例为10g：(10～15)mL；所述均质时间为1～3min；所述超声萃取时间为1～3min；所述离心条件为：转速为7000～8000rpm，离心时间为8～12min。5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱采用CHIRALCEL OJ-RH手性柱；优选的，所述CHIRALCEL OJ-RH手性柱型号为：粒径为5μm，柱内径为4.6mm，柱长为150mm。6.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)中，所述乙酸铵水溶液中的乙酸铵的含量为8～12m...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑金鹏，王珊珊，李福伟，王晓利，赵汝松，陈跃，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东;37