修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法，该干细胞制剂包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂解液，还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔。创伤愈合是细胞因子与效应细胞相互作用的结果，外源性细胞因子的局部使用可有效促进创伤愈合，本发明专利技术将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，制成干细胞制剂，相互作用可有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法。
技术介绍
慢性皮肤溃疡又称难治性皮肤溃疡，是一种常见的难治性疾病，具有病因复杂、病程长和反复发作特点，可引起皮肤表皮和部分真皮甚至皮下脂肪缺损。致病因素包括糖尿病、外伤、压迫和感染等，其中糖尿病为主要原因。目前，我国糖尿病患者约9200万，15％～25％患者在其疾病过程中将发生足溃疡。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCS)是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。近来有研究报道，在骨髓、软骨和脂肪组织之外的脐带血和脐带等胎儿附属组织中发现了MSCS。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，具有自我复制和定向分化潜能特点，由于其可通过旁分泌效应和向类皮细胞分化参与创伤愈合的各个阶段，具有治疗皮肤溃疡的潜在价值。目前，尚无慢性皮肤溃疡治疗指南，临床上多采用清创术、负压疗法、抗感染药物及敷料处理，这些方法都达不到兼具促进创面愈合和保护创面的作用，治疗效果不尽人意。
技术实现思路
本专利技术需解决的技术问题是提供一种可有效促进创伤愈合的修复皮肤溃疡的干细胞制剂。为解决上述的技术问题，本专利技术设计了一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂解液。作为本专利技术进一步改进，所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔。作为本专利技术进一步改进，所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂还包括6～10U/mL的强力霉素。本专利技术还提供了上述修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：S1：制备间充质干细胞的步骤，包括：S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤液；S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；S2：制备血小板血浆裂解液的步骤，包括：S21：获取骨髓，离心，吸取上层及中间的有核细胞；S22：再离心，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；S23：对所述细胞悬液离心，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；S3：配制所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。创伤愈合是细胞因子与效应细胞相互作用的结果，外源性细胞因子的局部使用可有效促进创伤愈合，本专利技术将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，制成干细胞制剂，互相作用可有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。具体实施方式为了使本领域相关技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。本专利技术提供一种干细胞制剂，用于治疗皮肤溃疡，促进创伤的愈合。该干细胞制剂将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，即外源性细胞因子(血小板血浆裂解液)和效应细胞(间充质干细胞)相互作用，可有效地促进创伤愈合。在本专利技术实施方式中，间充质干细胞的浓度为4～6×107个/ml和血小板血浆裂解液的体积分数为5％-20％。在其中，还包括有30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液、5～15μmol/L的法舒地尔和6～10U/mL的强力霉素。本专利技术还提供了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1：制备间充质干细胞：S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤液；S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；S2：制备血小板血浆裂解液：S21：获取骨髓，离心，吸取上层及中间的有核细胞；S22：再离心，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；S23：对所述细胞悬液离心，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；在之后，还对所述血小板血浆裂解液进行冻存，再解冻，反复冻存解冻至少3次以上。S3：配制所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液、30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔以及6～10U/mL添加的步骤添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。下面结合具体的实施例对本专利技术进一步详细说明实施例一：制备间充质干细胞悬液取足月剖宫产胎儿的脐带约4～6cm长，在无菌条件下抽净脐带血，将约4～6cm长脐带放入超净台中，去除动静脉及外膜，PBS进行初次漂洗几次，剪成1cm小段，再用PBS多次漂洗以尽可能去除血液，最后剪成肉糜状。将肉糜状人脐带组织块移入50mL离心管，加入5mL的、经37℃预热的、质量分数为0.1％的胶原酶Ⅱ(100mlPBS缓冲液溶解0.1g胶原酶)，放入37℃水浴摇床中振荡消化180min，再加入30mL的DMEM/F12培养，反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液。该滤液用1000转/min离心10min，弃上清，将离心沉淀下来的细胞按1×106/mL的密度用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养，次日首次换液，以后每3d换液1次。当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶液配制：PBS缓冲液200mL，胰蛋白酶0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液。制备血小板血浆裂解液无菌条件下用含100U/mL低分子量肝素钠的无菌针管从髂后上脊取骨髓30mL，生物安全柜中转入50mL的无菌离心管中，在200g/min的条件下离心6min，离心后可见骨髓分为3层，吸取上层及中间富含的有核细胞，将有核细胞转至另一离心管，1000g离心6min，弃上清液；下层加入DMEM培养液(含体积分数为10％血清、8U/mL强力霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％‑20％的血小板血浆裂解液。

【技术特征摘要】
1.一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，包括浓度为
4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂
解液。
2.根据权利要求1所述的修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，
还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15
μmol/L的法舒地尔。
3.根据权利要求2所述的修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，
还包括6～10U/mL的强力霉素。
4.一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括
以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培
养，过滤，收集滤液；
S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％WT
的FBS的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，
传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44