双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了8个新SSR分子标记和2个已有SSR分子标记的有效组合，并将它们应用于菌种鉴定。以22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩增，每对引物扩增后进行丙烯酰胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行组合，构建双孢蘑菇22个不同菌株的分子身份证。本发明专利技术提高了双孢蘑菇菌种鉴定的效果，对于双孢蘑菇的资源鉴定、保护和开发利用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用。技术背景双孢蘑菇(Agaricusbisporus)的人工栽培迄今已有300多年的历史,是当今世界上第一大宗食用菌。因其味道鲜美、营养丰富,深受人们的喜爱,在世界各地广为栽培,尤其是近几年来,双孢蘑菇的商业化、规模化栽培模式发展更是迅速。双孢蘑菇在我国福建等省已有大规模的规范化栽培,国内出口量已占世界第一位。随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高，食用菌的遗传研究已成为关注的热点之一。近年来，分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发展。而食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。形态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。同时，食用菌中同物异名的现象非常严重，严重的影响双孢蘑菇的生产和知识产权的保护，极大地损害了育种者和生产者的利益。因此，利用分子标记技术对双孢蘑菇的菌种进行分子水平的鉴定，结合农艺性状进行综合分析，对双孢蘑菇的菌种利用和保护，以及功能基因的开发具有重要的意义。目前，国外针对双孢蘑菇的SSR分子标记只有33对，国内还没有针对双孢蘑菇遗传多样性和菌种鉴定的专用SSR分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决双孢蘑菇同物异名、异物同名的问题，而提供一种双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用。双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：1）AbSSR034：F-TCAACGCTCTCTTCCAACCT；R-GCGGGCAGAGATCTTGTTAC；2）AbSSR035：F-GGCGTTCTGAATGATGATGA；R-AGCGTGTTTGGATGTGTTTG；3）AbSSR005：F-CTCTGGGATATGGACGAGGA；R-CCTCTTCACCTTGACCCTCA；4）AbSSR013：F-GACTGCCTGATTGACGGATT；R-TCCGACTCCGACATCCTATC；5）AbSSR015：F-CTCGAGTCGACGAAGGAAAC；R-TCCTCGGTTTCGACTGTACC；6）AbSSR016：F-TGTCTGGTTTTGCTCACGTC；R-TCAGCACACTTAATCGCACA；7）AbSSR018：F-TGGCTCTTTACAGCCTTGGT；R-TGCAGATGTGGTAGGAGTTTTG；8）AbSSR084：F-CGACCCATCATCAACTTCCT；R-AACGAGGGAAAGGTCGATTT；9）AbSSR6：F-ACCACATTCTGGAAAACGAA；R-TTAATGCTCTTGGCTTCGAC；10）AbSSR36：F-CGTTGATGGAGTTGACTGAG；R-ACAACAAAATCGTCGTGAGG。本专利技术的又一个目的是提供一种双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系在菌种鉴定方面的应用。本专利技术提供了8个新SSR分子标记和2个已有SSR分子标记的有效组合，并将它们应用于菌种鉴定。以22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩增，每对引物扩增后进行丙烯酰胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行组合，构建双孢蘑菇22个不同菌株的分子身份证。本专利技术对于双孢蘑菇的资源鉴定、保护和开发利用具有重要意义。附图说明图1AbSSR034和AbSSR035产生的带型(AbSSR034泳道为菌株CCMJA3；AbSSR035泳道为菌株CCMJA3)；图2AbSSR005产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA6、CCMJA41、CCMJA27、CCMJA43、CCMJA44、CCMJA47、CCMJA54、CCMJA57、CCMJA58）；图3AbSSR013产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA17、CCMJA3、CCMJA14、CCMJA56、CCMJA21、CCMJA44、CCMJA39、CCMJA47、CCMJA58）；图4AbSSR015产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA4、CCMJA2、CCMJA15、CCMJA51、CCMJA44、CCMJA9、CCMJA47、CCMJA57）；图5AbSSR016产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA5、CCMJA48、CCMJA13、CCMJA29、CCMJA33、CCMJA43、CCMJA47、CCMJA57、CCMJA58、CCMJA59）；图6AbSSR018产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA3、CCMJA47、CCMJA29、CCMJA54、CCMJA58）；图7AbSSR084产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA22、CCMJA29、CCMJA57、CCMJA58）；图8AbSSR6产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA7、CCMJA54、CCMJA29、CCMJA44、CCMJA47）；图9AbSSR36产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA18、CCMJA3、CCMJA32、CCMJA27、CCMJA47、CCMJA57）。具体实施方式实施例1双孢蘑菇EST-SSR标记引物的开发一、SSR引物设计和合成：从JGI数据库中双孢蘑菇H97基因组数据(version2.0)(http://genome.jgi-psf.org/.)搜索并下载，利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/tools.php)搜索SSR，搜索标准为：二、三、四、五、六核苷酸的最少重复次数大于等于5次。利用引物设计软件Primer3.0在含有SSR位点的序列中设计引物。SSR引物设定参数为：(1)GC含量为45%-60%；(2)退火温度为60℃；(3)预期片段长度在150-300bp之间；(4)引物长度在18-27bp之间。二、SSR引物的筛选(1)利用康为世纪的基因组提取试剂盒提取待鉴定样品总DNA；(2)利用随机的10个双孢蘑菇菌株对设计的SSR分子标记引物进行初筛：以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用上述设计的100对引物进行PCR扩增。PCR反应用BioRadPCR仪。PCR扩增条件如下:95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计30个循环；72℃延伸l0min。PCR采用20μL反应体系：DNA20-50ng，10×缓冲液2.0uL，2.5mM的dNTPs2.0uL，Taq酶0.25μL，浓度为10uM的上游引物溶液0.3μL，浓度为10uM的下游引物0.3μL，添加ddH2O至体系体积为20uL；(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：1）AbSSR034： F‑TCAACGCTCTCTTCCAACCT；R‑GCGGGCAGAGATCTTGTTAC；2）AbSSR035： F‑GGCGTTCTGAATGATGATGA；R‑AGCGTGTTTGGATGTGTTTG；3）AbSSR005： F‑CTCTGGGATATGGACGAGGA；R‑CCTCTTCACCTTGACCCTCA；4）AbSSR013： F‑GACTGCCTGATTGACGGATT；R‑TCCGACTCCGACATCCTATC；5）AbSSR015： F‑CTCGAGTCGACGAAGGAAAC；R‑TCCTCGGTTTCGACTGTACC；6）AbSSR016：F‑TGTCTGGTTTTGCTCACGTC；R‑TCAGCACACTTAATCGCACA；7）AbSSR018：F‑TGGCTCTTTACAGCCTTGGT；R‑TGCAGATGTGGTAGGAGTTTTG；8）AbSSR084：F‑CGACCCATCATCAACTTCCT；R‑AACGAGGGAAAGGTCGATTT；9）AbSSR6：F‑ACCACATTCTGGAAAACGAA；R‑TTAATGCTCTTGGCTTCGAC；10）AbSSR36：F‑CGTTGATGGAGTTGACTGAG；R‑ACAACAAAATCGTCGTGAGG。...

【技术特征摘要】
1.双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：
1）AbSSR034：F-TCAACGCTCTCTTCCAACCT；R-GCGGGCAGAGATCTTGTTAC；
2）AbSSR035：F-GGCGTTCTGAATGATGATGA；R-AGCGTGTTTGGATGTGTTTG；
3）AbSSR005：F-CTCTGGGATATGGACGAGGA；R-CCTCTTCACCTTGACCCTCA；
4）AbSSR013：F-GACTGCCTGATTGACGGATT；R-TCCGACTCCGACATCCTATC；
5）AbSSR015：F-CTCGAGTCGACGAAGGAAAC；R-TCCTCGGTTTCGACTGTACC；
6）AbSSR016：F...

【专利技术属性】
技术研发人员：付永平，王新新，李玉，王琦，李丹，宋冰，张春兰，苏文英，戴月婷，郭毓秀，段明正，刘源，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22