一种表达载体制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种表达载体，其含苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus AcMNPV)立即早期1启动子(AcIE1启动子)和同源区域5(homologous region 5)增强子(hr5增强子)及核多角体病病毒(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virus，OpMNPV)立即早期2启动子(Opie2启动子)的昆虫表达载体，含此表达载体的昆虫宿主细胞以及用该表达载体制备重组蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，涉及一种表达载体。
技术介绍
-些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒（VLP)的重 组蛋白异源表达的重要宿主（Cherezov等，2007 ;Imasaki等人，2011 ;Rasmussen等人， 2007;White等人，2012)，（Metz和Pijlman，2011;Shrestha等人，2007;Treanor等人， 2011 ;Treanor等人，2011年）。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统（BEVS)来感染源 自鳞翅目的细胞系。（Berger等人，2004 ;Jarvis，2009;Kost等人，2005 ;Summers，2006) 〇 最常用的宿主是来自于Spodopterafrugiperda的Sf21和Sf9以及来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系（又称HighFive或Tn-5)。这些细胞能在悬浮培养下生长到 很高的细胞密度，并且能够执行翻译后的蛋白质修饰，包括Ν-和0-端糖基化（Kost等人， 2005 ;贾维斯，2009)。当使用BEVS用于基因递送时，Tn-5细胞是生产分泌蛋白质的优选宿 主（Drugmand等人，2012;Granados等人，1994)。 尽管BEVS的运用非常成功，其还是存在几个缺点。杆状病毒载体的生成将可能需 要长达3个星期（Jarvis，2014年）。因为病毒引起的细胞裂解，蛋白生产阶段的持续时间 被限制在约3-4天以内。分泌蛋白和细胞表面蛋白的通常产量往往小于10μg/mL，而细胞 内蛋白质的产量已经有报道达到了 100μg/mL(Harrison和Jarvis，2007 ;Jarvis，2009)。 可以通过稳定转染昆虫细胞系来替代使用BEVS瞬时生产蛋白质的方法。但是，这种方法不 仅费时，而且蛋白产量通常很低（Harrison和Jarvis，2007 ;Drugmand等人，2012)。 通常使用BEVS来构建表达载体是将目的基因人工连接于杆状病毒的晚期（late) 和/或非常晚期（verylate)启动子之后，利用其强力启动子，以期能表达较大量的目标蛋 白。但该方法存在非常明显的缺陷，即通常在晚期（late)或非常晚期（verylate)启动子 开始表达之后，宿主细胞将在两三天内快速死亡，无法达到长期表达的目的。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种能长时间稳定大量表达目的基因的表达载体。 本专利技术目的之二在于提供含上述表达载体的宿主细胞。 本专利技术目的之三在于提供一种利用上述载体制备重组蛋白的方法及其获得的蛋 白。 专利技术通过以下技术方案实现： 首先，专利技术提供了一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有： a.hrx增强子或其功能片段或序列变体；b.AcIEx启动子或其功能片段或序列变体；和 c. 0piex启动子或其功能片段或序列变体。 所述的hrj强子为AcMNPV中的hr5增强子、Bombyxmori中的hr3增强 子，AcMNPV中的hr3增强子；优选地，为AcMNPV的hr5增强子。 所述的AcIE$动子为AcMNPV中的AcIE1启动子。 所述的Opieja动子为OpMNPV中的0pie2启动子、Opiel启动子；优选地，为 OpMNPV中的0pie2启动子。 优选地所述hrdi强子、AcIEx启动子功能片段和Opiex启动子依次连接。AcIE:启动子： 优选地，所述AcIEx启动子功能片段为AcIEx启动子序列的01为到352位；优选 01为到188位；更优选01为到119位。 在本专利技术的一个优选的实施方案中，采用了AcIEl启动子。作为可选的方案，可采 用如SEQNOID. 7所示序列或与其具有70%以上同源，优选80%以上同源，更优选90%以 上同源，更优选95%以上同源，最优选98%以上同源的序列。在本专利技术的一个优选的实施 例中，采用了如SEQNOID. 7所示序列。 Opie^启动子： 可选地，所述0pie：^动子可采用如SEQNOID. 6第614-1161所示序列或与其具 有70%以上同源，优选80%以上同源，更优选90%以上同源，更优选95%以上同源，最优选 98%以上同源的序列。在本专利技术的一个优选的实施例中，采用了如SEQNOID. 6第614-1161 所示序列。 hr^增强子： 作为可选的方案，可采用如SEQNOID. 6第1-482所示序列或与其具有70%以上 同源，优选80%以上同源，更优选90%以上同源，更优选95%以上同源，最优选98%以上同 源的序列。 在本专利技术的一个优选的实施例中，采用了如SEQNOID. 6第1-482所示序列。 含优诜的调棹单元的载体示例： 作为一种优选的方案，本专利技术通过提供一种操作性连接于编码所需重组蛋白的异 源基因序列的含有AcMNPV中的AcIEl启动子片段和hr5增强子，以及OpMNPV的0pie2启动 子的昆虫细胞表达载体而得到解决。所述hr5增强子加位于hr5增强子下游的AcIEl启动 子片段和0pie2启动子构成了驱动下游编码序列表达的调控单元。本专利技术的昆虫细胞表达 载体是由AcMNPV的立即早期启动子AcIEl启动子片段和OpMNPV的立即早期启动子0pie2 启动子控制，从而能在宿主细胞中保持长期的表达，而不会造成宿主细胞的死亡。令人惊喜 的是，本专利技术载体的表达盒中包含的与AcIEl启动子片段和hr5增强子组合的0pie2启动 子驱动的异源蛋白产物表达水平高于只含有AcIEl启动子和hr5增强子的载体所见水平。 专利技术人认为0pie2启动子的存在明显促进了从相应的mRNA有效合成蛋白。 在本专利技术的一个特别优选的实施例中，本专利技术载体的序列如SEQNOID. 6所示。 除了编码重组或异源基因产物的DNA序列外，该表达载体还包含在宿主细胞中能 有效转录编码序列的mRNA和有效翻译所述mRNA所必需的调控DNA序列。具体说，本专利技术 的表达载体包含至少一个调控单元，其包含操作性连接于重组蛋白编码序列的与AcIEl启 动子片段和hr5增强子联合的至少一个0pie2启动子序列，并驱动编码蛋白的表达。包含 AcIEl启动子片段和hr5增强子及0pie2启动子的所述调控单元与异源基因的编码序列直 连，或通过间插的DNA(例如：通过异源基因的5'非翻译区或其一部分）而与异源基因的编 码序列分隔。 "启动子"定义为一种通过引导RNA聚合酶连接到DNA并启动RNA合成来介导转录 起始的DNA序列。 本专利技术优选采用的AcIEl启动子也可以是AcIEl启动子的功能性片段或其功能 性序列变体。因此，具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动 重组或异源产物基因表达的AcIEl启动子的任何序列变体或片段均可用作AcIEl启动子。 AcIEl启动子的"功能性变体"包括含有碱基插入、删除或点突变的天然AcIEl序列，可用本 领域熟知方法产生，如引物-定向PCR、'易错PCR'、重叠DNA片段的被称为'基因重组'的 PCR-重装，或先在体内随机诱变细胞克隆，再经文库转染和在Tn-5细胞中进行功能性选择 来产生。例如，随机诱变或通过烷化化学试剂或UV辐射来实现。任本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于包含至少一个调控单元，所述调控单元含有：a.hrx增强子或其功能片段或序列变体；b.AcIEx启动子或其功能片段或序列变体；和c.Opiex启动子或其功能片段或序列变体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈潇，林兴华，
申请(专利权)人：广州晓经生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44