本发明专利技术涉及一种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法，本发明专利技术通过Primer的不断产生和循环利用来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。本发明专利技术制备的生物传感器特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。通过这种检测方法，沙门氏菌检测限在5-15cfu/mL，检测范围是1×10-1×107cfu/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生 物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比 率。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研究表 明鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。调查中，鼠伤 寒沙门氏菌感染数量占当年沙门氏菌感染总量的17%。同时，在我国境内已发现的290余 种沙门氏菌血清型中，鼠伤寒沙门氏菌也是最常见的血清型之一。 目前，主要用来检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括生化鉴定和血清分型。但此方法 存在自身不可避免的缺点与限制，需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程， 耗时一周左右，不利于快速、准确地对食品中的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。因此，有必要 建立一种高效快速检测鼠伤寒沙门氏菌的新方法。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测鼠伤寒沙门氏菌的方法特异性和灵敏度都比较低、成本 高的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检 测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。通过这种检测方法，沙门氏菌检测限在5-15cfu/mL，检测 范围是1X10-1X1〇7cfu/mL(cfu为菌落总数）。 本专利技术还提供了基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制备方法。 本专利技术是通过以下步骤得到的： 本专利技术中一共用到了 5 条DNA链，分别是：HAP1、HAP2、Primer、Aptamer、Helper。 其序列分别为： HAP1 ：5, -AGTAATGCCCGAAAAGGAAAAGAGGAGACTTTTCGGGCATTACTCGTACAAGTAATGCCMkk-V(SEQIDN0:1)； HAP2 :5, -SH-AGCCAGTCTCAGGGAAAAGTGGCT-MB-3，（SEQIDNO:2); Primer:5'-TCTTTTCCTTTTCGGGCATTACT-3'（SEQIDNO:3); Aptamer：5, -AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3?(SEQIDN0:4)；Helper：5, -AGTAATGCCCGAAAACTGAGAC-3'(SEQIDN0:5)〇 Aptamer是目标物鼠伤寒沙门氏菌的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密 结合。其中5'端(斜体部分）和3'端(黑体部分）分别与Primer的3'端(斜体部分）和5' 端(黑体部分）杂交，当有目标物存在时，Aptamer会优先于目标物结合从而释放Primer。 其中发夹结构的序列HAP1中，加粗序列部分为Primer的互补序列，划线部分为酶 切序列，3'端斜体部分为Primer的部分互补序列，是暴露的，当Primer存在时，可与其互 补结合，在Phi29DNA聚合酶作用下以HAP1为模板，从3'端向5'端延伸，并将发夹打开。 得到的双链在酶切位点处切开，产生新的Primer，实现一级放大。 HAP2的5'端修饰有巯基（-SH)，可以与金电极形成稳定的Au-s键，从而将HAP2 固定在电极表面，3'端修饰有亚甲基蓝（MB)。当HAP2维持发夹状的时候，MB是与电极表面 接近的，有较大的电信号；当Primer的5'端(黑体部分）和Helper的3'端分别与HAP2的 黑体部分和划线部分相结合时，Primer的3'端(划线部分）与Helper的5'端(划线部分） 结合，这种两两结合的构象形成了三条链的Y型构象，由内切酶在HAP2的酶切位点处切开， 释放Primer和Helper，循环利用，完成二级放大。 本专利技术中用到了两种酶：Phi29DNA聚合酶和Nt.BsmAI内切酶。Phi29DNA聚 合酶同时具有链延伸和置换功能，Nt.BsmAI内切酶在双链序列5'…GTCTCNN…3'两个N 之间进行切割。 本专利技术中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相反应和电极表面中实现的，通过Primer 的不断产生和循环利用来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获 得较低的检测下限。 均相中发生的反应主要有：在有目标物鼠伤寒沙门氏菌存在的情况下，目标物与 Aptamer结合，将原本与Aptamer结合的Primer引物竞争下来释放。被释放的Primer与 HAP1暴露的3'端部分结合，在Phi29DNA聚合酶与dNTP的共同作用下，以HAP1结构为模 板、Primer为引物发生延伸，在Nt.BsmAI内切酶的酶切位点处切割，释放新产生的Primer 序列，得到Primer产物。 在均相反应中，Primer引物竞争反应条件为37°C，反应时间是1h，聚合反应条件 为37°C，反应时间是2h。 电极表面发生的反应有：把均相反应中得到的Primer产物层低价到HAP2修饰 好的电极表面，HAP2的发夹打开，与Primer、Helper两两杂交，形成Y型构象，由内切酶在 HAP2的酶切位点处切开，释放Primer和Helper，循环利用。 在电极反应中，反应条件均为37°C，反应时间是2h。 -种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，在电极上依次修饰有 HAP2层、Primer产物层。 所述的生物传感器，HAP2层的厚度为10±2nm，Primer产物层的厚度为30±2 nm〇 所述的生物传感器，HAP1 (摩尔)、HAP2 (摩尔)、Primer(摩尔）、Aptamer(摩尔）、 Helper(摩尔)、聚合酶(活力)、连接酶(活力)和dNTP(活力)的摩尔与活性的比为1 :10 :1 : 1 :1 :40 :40 :2〇 所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤： (1)对电极进行预处理； (2 )将HAP2层修饰到电极表面； (3)将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，37°C，孵育2h。 所述的制备方法，优先将HAP2层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μΜ的ΗΑΡ2取10μL滴加到经过预处理的电极表面，在37°C下孵育2h。 所述的制备方法，操作步骤如下： (1) 将灭菌水，Aptamer、Primer和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒 温箱中孵育lh; (2) 将10X的buffer缓冲液、HAP1、Helper、dNTP、聚合酶和内切酶加入离心管中，震 荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; (3) 将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37°C的恒温 箱中孵育2h，清洗。 所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0. 3和0. 05Mm的氧化铝 浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。 所述的制备方法，优选所述电极为金电极。 该专利技术的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极， 铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定到电极 表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37°C孵育2h使均相中的Primer 产物和Helper与电极表面的HAP2完成杂交反应，从而将HAP2打开并酶切，使MB远离电极 表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，由以下方法制备而成：（1）对电极进行预处理，取金电极，在0.3和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗；（2）将10 μM的HAP2取10 μL滴加到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2 h；（3）将灭菌水，Aptamer、Primer和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；再将10×的buffer缓冲液、HAP1、Helper、dNTP、聚合酶和内切酶加入以上离心管中，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2 h，清洗；所述的HAP1、HAP2、Primer、Aptamer、Helper、聚合酶、连接酶和dNTP的摩尔与活性的比为1：10：1：1：1：40：40：2；所述聚合酶为Phi29DNA聚合酶；所述内切酶为Nt.BsmAI内切酶；HAP1 的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；HAP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；Helper的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，王玉，邱婷婷，黄加栋，王虹智，郭玉娜，崔洁，许颖，崔雪君，裴倩倩，冷雪琪，韩聪，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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