本发明专利技术涉及一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用，该菌株是伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhi)ΔcrpST-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC?NO：M2011373。本发明专利技术的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保护性，且毒力较弱，对免疫猪无任何不良副作用，跟传统该类疫苗相比更安全。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景。另外，本发明专利技术伤寒沙门氏菌基因缺失菌株保留了针对伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，而且遗传背景清晰，性状稳定，因而具有更好的生物安全性。本发明专利技术伤寒沙门氏菌基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种不含抗性标记 的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，由其构建的疫苗及该疫苗的应用，属于动物细菌基因工程
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物体内的一种革兰氏阴性杆菌。在人、家畜、家禽、野生动物、啮齿动物体内常分离到沙门氏菌，本属细菌也常存在于水、乳、肉、蛋中及其他食品和饲料中。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。某些沙门氏菌是重要的人畜共患病原，有些是动物疾病病原，有些是人和动物食物中毒或饲料中毒常见病原性细菌，因而本属细菌在食品卫生、外贸出口、人畜疾病发生中均十分重要。据统计在世界各国的各种细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。细胞免疫在抗沙门氏菌感染中具有重要作用。细胞免疫反应性与大剂量沙门氏菌攻击动物的保护性通常呈现很好的相关性。但体液抗体可加速病原菌的排出。动物接触环境中的沙门氏菌或在注射疫苗后，其体液免疫应答主要是IgM抗体。在疾病康复或口服弱毒苗感染的动物肠道中，可出现特异性分泌型IgA。动物在感染沙门氏菌病愈后，可获得坚强的免疫力，能抵抗再次感染。目前应用的兽用疫苗多限于预防各种家畜特有的沙门氏菌病，例如猪霍乱沙门氏菌(S. choleraesuis)、马流产沙门氏菌(S. abortusequi)以及牛、羊都柏林沙门氏菌(S. dublin)等灭活疫苗，在国内外均已应用，两次接种即可预防孕畜流产或幼畜感染。据报道，用减毒或无毒活菌注射或口服免疫动物，效果优于灭活菌苗。人类感染的沙门氏菌主要来源于畜禽，而沙门氏菌感染家畜后可引起一系列的临床疾病并成为肉制品污染的一个重要来源。因此，国内外动物检疫规程均把沙门氏菌列为重要的卫生检出指标之一。伤寒沙门氏菌(S.typhi)是一种常见、重要的人畜共患肠道病原菌，不仅能导致鸡白痢、家畜流产等动物性疾病发生，还能使人类发生伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒等疾病。1877年几乎同时由德国细菌学家Karl Joseph Eberth和RobertKoch从伤寒病人粪便中发现伤寒沙门氏菌，1884年德国细菌学家Georg T. A. Gaffky从病人脾脏中再次分离到该病原菌，并鉴定出其抗原结构式为9，12，[Vi]:d:-，为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，具周身鞭毛，能运动，不形成芽孢。伤寒沙门氏菌能引起人和动物全身性、急性、发热性的感染，致病菌主要侵入网状内皮系统、肠道淋巴结及胆囊，并导致广泛的全身性临床症状，主要表现为持续性高热、腹痛及小肠结肠炎等症状。在成人和年长儿童常出现便秘，而幼龄儿童则常出现腹泻。虽然随着社会卫生条件的改善，可降低伤寒的发病率，但由于耐药菌株的不断增多，应用免疫预防手段仍然是控制本病的有效措施，因此伤寒疫苗的研究对预防伤寒病的发生具有更实际的意义。目前在全世界各地获准使用的伤寒沙门氏菌疫苗主要有热灭活-酚防腐全菌体疫苗或经丙酮灭活冻干全菌体疫苗，纯化Vi多糖疫苗，口服减毒Ty21a减毒活疫苗。由于灭活苗具容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。多糖结合疫苗生产工艺较难、成本高，在发展中国家推广仍有一定困难。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活疫苗或亚单位疫苗更为有效。于是,尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被弱毒活疫苗所取代。各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果(Curtiss R，III，Doggett T,Nayak A,Srinivasan J. 1996. Strategies for the use of live recombinantavirulent bacterial vaccines for mucosal immunization,p. 499-511. In H. Kiyono andM. F. Kagnoff (ed. ), Essentials of mucosal immunology. Academic Press, San Diego,Calif ；Sirard J C,Niedergang F,Kraehenbuhl J P. 1999. Live attenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 :5_26)。Ty21a 是由野生型 Ty2 经化学剂亚硝基胍处理而获得的株，该株毒力明显降低，可提供67 79%的免疫保护力，因此许多国家生产并应用该型减毒活疫苗，使伤寒病得到有效控制。但该弱毒疫 苗菌株由野生强毒株经过化学致弱方法制得，遗传背景不清，存在毒力返强的风险。因此，仍然需要开发遗传背景清楚、性状稳定、更符合生物安全性的新型伤寒沙门氏菌弱毒疫苗。随着现代分子生物学和DNA重组技术的发展以及许多其他毒力或毒力相关基因的不断发现，许多研究者仍在不断以改进某些毒力或毒力相关基因来制备新的弱毒活疫苗。使用基因工程手段致弱沙门氏菌从而筛选获得弱毒疫苗株已经成为国际上的研究热点。这主要是因为新型弱毒沙门氏菌疫苗不仅能用于沙门氏菌病的防制，而且能作为开发其它多种传染病疫苗的载体(Sirard J C, Niedergang F, Kraehenbuhl J P. 1999. Liveattenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 5~26 ；Spreng S, Dietrich G. Weidinger G. . 2006. Rational design of Salmonella-basedvaccination strategies. Methods 38 :133-143)。与致病性密切相关的沙门氏菌毒力因子主要包括脂多糖、肠毒素、细胞毒素、侵袭力与毒力基因及毒力调节基因等。人们尝试通过各种基因工程手段缺失其中的某些毒力相关基因，致使沙门氏菌毒力降低，但仍保留其免疫原性，最终筛选获得沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株。研制中的减毒伤寒沙门氏菌口服疫苗主要有以下几种aroA (编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)和purA (编码嘌呤的生物合成)株541Ty、aroA和aroD株CVD906、cya (编码环化腺苷酸合成酶)和crp (编码cAMP受体蛋白)株X 3927、cya、crp和cdt (编码深部组织的繁殖)株x 4073、phoP/phoQ基因(编码转录激活因子/传感器激酶)株Ty800 (Hohmann E L，Oletta C A7MillerS I.1996.Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonellatyphi vaccine strain in human volunteers. Vaccine, 14(1) :19-24)等等。理想的弱毒活疫苗应具备下列条件(I)完全无毒力株的残余毒性一般不被本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，其特征在干该菌株是伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi) Λ crpST-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2011373。2.根据权利要求I所述的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，其特征在于该菌株的缺失了环化腺苷酸(cAMP)受体蛋白基因crp中320bp的DNA片段。3.一种由权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵战勤，薛云，王臣，王浩，周金龙，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：
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