用于生产重组兴趣蛋白的方法技术

公开了用于生产重组兴趣蛋白的方法，所述方法特征在于如下步骤：(a)提供包涵体中的包含Npro自我蛋白酶部分和兴趣蛋白部分的融合蛋白，(b)溶解所述包涵体，(c)允许所述Npro自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白，其中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来，以及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或同时复性，以及(d)回收所述兴趣蛋白，任选地包括兴趣蛋白的复性步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及通过使用攝病毒技术的自我蛋白酶NP"来重组生产所需的兴趣异源多 肤的方法。
技术介绍
大肠杆菌巧.coli)被广泛用于大量表达治疗性蛋白。对于医疗应用，同源 (homogeneous)N端是重要的，但是通过甲硫氨酸氨肤酶对N-甲酯甲硫氨酸去除不全的话 可能导致不希望的微观不均一'性（microheterogeneity)。此外，基因融合技术通常用于重 组蛋白的表达。一些常用的融合标签（例如谷脫甘肤-S-转移酶（GST)、麦芽糖结合蛋白 (MB巧或者硫氧还蛋白）介导溶解度，而其它的（例如聚-His、FLAG、Str巧II或者巧调蛋 白结合肤（CB巧）则作为亲和标签使得易于纯化。基因融合技术需要通过具有不同切割效 率和特异性的酶或者化学切割，将标签从最终蛋白产物中去除。自我切割标签（如内含肤、 分选酶A(SdA)、化pC蛋白或者半脫氨酸蛋白酶结构域（CPD)化及NPm自我蛋白酶）为制 药相关蛋白的表达提供了一种有用的替代方案。Li,Biotech.Let. 33(2011) :869-881中公 开了用于重组蛋白生产的自我切割融合标签；Xing等人，Microb.CellFact. 10(2011) :42 报道了使用可切割的自聚集标签进行的流线型（streamlined)蛋白表达和纯化。 异源蛋白在大肠杆菌中的过度表达经常导致致密的聚集和沉积、不溶性的颗粒， 也被称为包涵体。在包涵体中表达的优点是所需产物为高纯度，W及在细胞破碎后容易通 过离屯、进行纯化。然而，关键的步骤是溶解蛋白并将其再折叠成其天然结构。溶解通常在 高浓度的离液序列高的试剂（如尿素或者盐酸脈）中进行，W达到完全的展开。加入还原 剂（如2-琉基乙醇（P-ME)、二硫苏糖醇值TT)或者1-硫代甘油（MTG))W减少非天然的 分子间和分子内二硫键，并使得半脫氨酸保持其还原状态。再折叠时启动自我蛋白酶解的 切割和随后融合配偶体（partner)的释放，其遵循单分子反应，且反应速率只依赖于离液 剂浓度扣eberbacher等人，ProcessBiochem. 44(2009), 1217-1224)。 瓶颈步骤是蛋白的复性。在再折叠的第一步，消除疏水分子间的相互作用 对于在高蛋白浓度中成功复性是关键的，并防止聚集（Vallejo等人，Microb.Cell Fact. 3(2004)，11)。多种复性技术是已知的。通过稀释进行再折叠，由于其简单性，而优于 压力处理或者色谱技术，尤其是在规模生产时。在单一步骤中减少蛋白浓度W及离液剂浓 度，防止通过分子间的相互作用而聚集。然而，大体积和低蛋白浓度给下游加工步骤带来负 担（Jungbauer等人，J.Biotech. 128 (2007), 587-596)。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供包涵体的复性改善，包涵体必须是复性的，尤其是 对于方法下游的自我蛋白酶解切割和重组蛋白的制备。优选地，本专利技术应当实现小体积和 高的蛋白浓度W获得兴趣蛋白，并提供一种适于在工业生产规模建立的方法，特别是对于 医药用途的蛋白。此外，将自我蛋白酶的复性步骤和兴趣蛋白的复性步骤分开也是有益的， 将有助于实现高度特异性的复性条件。 因此，本专利技术提供一种，特征在于如下步骤： (a)提供包涵体中的包含NPm自我蛋白酶部分（moiety)和兴趣蛋白部分的融合蛋 白，[000引 化）溶解所述包涵体， (C)允许所述NP"自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白，其 中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来，W及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或 同时复性，W及 (d)回收所述兴趣蛋白，任选地包括所述兴趣蛋白的复性步骤。 本专利技术是通过使用攝病毒技术的自我蛋白酶NP"在所需兴趣异源多肤的重组生产 中的改进。运种技术通常提供在宿主细胞（通常是原核宿主细胞，例如大肠杆菌）中融合 多肤的重组表达，其中融合多肤包含直接或者间接源自攝病毒自我蛋白酶NPm的自我蛋白 酶解部分W及异源兴趣多肤。异源多肤或者兴趣蛋白通过肤键与NP"分子共价偶联。通过 水解化roC端切S168和融合多肤169位置之间的肤键，将兴趣蛋白从融合蛋白中释放，其 中融合多肤169位置代表根据本专利技术待生产的兴趣蛋白的真实N端氨基酸。在宿主细胞中 W细胞质包涵体（IB)的形式生产异源兴趣多肤，然后按照运样的方式分离并处理包涵体， 即通过NPm的自我蛋白酶解活性将所需的异源多肤从融合多肤中切割下来。 因此，包含攝病毒的自我蛋白酶NP"的融合多肤，对于生产异源重组多肤而言特别 有用。NP"是长度为168个氨基酸的自我蛋白酶，并且体内表观Mf约20kD。它是攝病毒多 聚蛋白（polyprotein)中的第一蛋白，并且进行自我蛋白酶解切割从其后的核衣壳蛋白C 上切割下来。在NP"序列中的最后一个氨基酸切S168后发生运种切割。攝病毒自我蛋白 酶NPm的活性总是在运一明确的位点上切除融合配偶体，释放具有同源N端的兴趣多肤。此 夕F，通过应用特殊的缓冲液可W在体外诱导NPm的自我蛋白酶解活性，从而通过切割IB中 表达的融合多肤而获得兴趣多肤。 此技术中使用的来自传统猪攝病毒（CSFV)的N端自我蛋白酶NP"用作尤其是在大 肠杆菌中大量表达治疗性蛋白的有吸引力的工具。医药应用需要重组蛋白的真实N端，运 可W通过N端融合的NP"自我蛋白酶的自我切割来实现。此外，NP"融合技术也允许表达小 的或者毒性的肤，在其合成之后宿主细胞蛋白酶将立即降解小的或者毒性的肤（Achmilller 等人，化t.Methods4(2007), 1037-1043)。由于N。"融合蛋白在大肠杆菌中的表达导致不 溶性聚集物（被称为包涵体）的形成，需要适当的溶解和复性操作W便获得生物活性的蛋 白。 如已经提到的，在大多数情况下，溶解是在高浓度离液序列高的试剂（如尿素或 者盐酸脈）中进行的，同时组合使用还原剂来消除错误形成的二硫键。通过稀释进行再折 叠由于其简单性而广泛用于起始复性。因此，加入大量的缓冲液W提供允许形成正确生物 活性结构的条件。因此，根据本专利技术，应用了在高尿素浓度时显示出切割活性的自我蛋白 酶。运使得能够显著降低溶解步骤后所需缓冲液的量，从而降低成本。此外，如果祀标蛋白 和自我蛋白酶需要不同的复性条件，运两个步骤可W分开，运给运种优选实施方式增加了 另一优点。在高离液序列高的条件下自我蛋白酶的活性将自我蛋白酶的复性步骤和祀标蛋 白的复性步骤分开，从而能够实现高度特异性的复性条件。实际上，兴趣蛋白的复性可W和 自我蛋白酶的切割步骤分开，使得更好地控制兴趣蛋白的回收。在运种情况下，然后可w在 随后的任何阶段和不同的地方，使兴趣蛋白获得充分的活性。在现有技术中，自我蛋白酶部 分（其导致融合蛋白的切割）的活性恢复总是和包含兴趣蛋白部分的整个融合蛋白的复性 直接相关。本专利技术优选的实施方式允许将自我蛋白酶和祀标蛋白的再折叠分开。 因此，在一个优选的方法中，在重组生产系统中，优选在原核宿主细胞中，尤其是 在大肠杆菌宿主细胞中产生包涵体。 步骤化）的优选条件对应着大于5M，优选大于6M，尤其是大于7. 5M的尿素浓度。 "对应着"表示尿素按照指定的量存在，或者存在某本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产重组兴趣蛋白的方法，特征在于如下步骤：(a)提供包涵体中的包含Npro自我蛋白酶部分和兴趣蛋白部分的融合蛋白，(b)溶解所述包涵体，(c)允许所述Npro自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白，其中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来，以及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或同时复性，以及(d)回收所述兴趣蛋白，任选地包括所述兴趣蛋白的复性步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·赖特迈尔，R·施耐德，B·奥尔，
申请(专利权)人：桑多斯股份公司，勃林格殷格翰RCV有限两合公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH