一种融合基因及其制备方法、融合基因表达载体及其构建方法、融合基因工程菌及其应用技术

本发明专利技术公开了一种融合基因及其制备方法、融合基因表达载体及其构建方法、融合基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。该融合基因，将蛋白转导域TAT连接入利尿多肽HKI序列，借助TAT的高效跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道系统内膜进入体内位点，确保HKI在体内运送过程中稳定发挥作用，使棉铃虫过度排泄死亡。本发明专利技术融合基因表达载体，将融合基因构建于植物表达载体pB Ⅰ 121中，由35S启动子驱动表达，在植株内高效表达，棉铃虫取食本发明专利技术融合基因表达载体遗传转化的转基因植株后3龄棉铃虫幼虫体重增幅明显减少，死亡率高。本发明专利技术融合基因工程菌，浸染待发芽植株，实现融合基因遗传转化植株，培育出转基因抗虫植株。

【技术实现步骤摘要】
一种融合基因及其制备方法、融合基因表达载体及其构建方法、融合基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种融合基因表达载体及其制备方法，同时还涉及一种融合基因表达载体的构建方法、融合基因工程菌及其应用。
技术介绍
棉铃虫，夜蛾科铃夜蛾属昆虫的一种，是棉花蕾铃期的大害虫，广泛分布在世界各地，中国棉区和蔬菜种植区均有发生，主要蛀食蕾、花、铃和嫩叶。棉铃虫天敌很多，有寄生性天敌—寄生蜂、寄生蝇等，捕食性天敌乌雀类及一些细菌、真菌、病毒等可对棉铃虫的卵和幼虫起到抑制作用。利尿激肽helicokininI(HKI)对棉铃虫的水分代谢活动刺激最为强烈(Seinscheetal.，2000)，在极微量的HKI注射进入棉铃虫幼体后，即可使其过度排泄，进而导致死亡，HKI作为杀虫物质进行应用的潜力巨大。由于其来源于生物体，对高等生物和环境安全，因此作为杀虫物质进行应用具有先天的环境优势。如何将HKI作为一种杀虫活性物质进行使用，是否可以利用害虫的取食行为将其摄入体内发挥作用；如何使有活性的短肽分子穿透消化道进入体内位点，同时保证短肽在运送过程中的稳定，这是亟待解决的问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种对棉铃虫具有强的毒杀活性的融合基因。本专利技术的目的之二在于提供一种融合基因的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种融合基因表达载体。本专利技术的目的之四在于提供一种融合基因表达载体的构建方法。本专利技术的目的之五在于提供一种融合基因工程菌。本专利技术的目的之六在于提供一种融合基因工程菌的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述融合基因由利尿多肽HKI和蛋白转导域TAT融合制备而成。上述融合基因的制备方法，包括以下操作步骤：1)将利尿激肽核苷酸连接在固相载体上，加入三氯乙酸反应，得到脱去5’—羟基的保护基团的利尿激肽核苷酸片段，记为片段1；2)将亚磷酰胺保护的蛋白转导域核苷酸单体与四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，记为片段2；3)片段1与片段2缩合反应，加入乙酸酐和1-甲基咪唑终止反应，然后加入碘，得到融合基因粗产品；4)将步骤3)制备的融合基因粗产品进行切割、纯化、定量，即得所述的融合基因。一种融合基因表达载体，包含有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。上述融合基因表达载体的构建方法，包括以下操作步骤：1)PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；2)将pBⅠ121质粒和步骤1)制备的融合基因扩增片段酶切后，进行连接，得连接产物；3)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆载体，提取质粒，酶切和测序结果正确的质粒命名为pBI121-TAT-HKI，即为所述的融合基因表达载体。步骤2)中酶切为BamHⅠ/SacⅠ双酶切。步骤1)中PCR扩增采用的引物为：P1：5’-CGCGGATCCATGTACGGCCGCAAG-3’；P2：5’-GCGAGCTCACGCCCCAGGGGCTG-3’(下划线为酶切位点)。步骤1)中连接的连接体系为：pBI121质粒大片段1.0μL、融合基因3.0μL、2×反应缓冲液5.0μL、T4DNA连接酶1μL；连接条件为：16℃连接反应24h。步骤3)中所述酶切为BamHⅠ/SacⅠ双酶切。一种融合基因工程菌，由融合基因表达载体转入宿主制备而得；所述融合基因表达载体包含有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。所述宿主为农杆菌LBA4404。上述融合基因工程菌可用于培育抗虫植株。TAT(transactivatoroftranscription，TAT)为病毒有效转录和复制所必须的多肽序列。TAT能够将与之共价连接的生物大分子非特异地转导细胞内部，这种过程既不依赖于受体和转运蛋白，也与温度和能量无关，而且对宿主细胞几乎没有毒性。这种具有携带外源蛋白穿透细胞膜能力的特异多肽序列称为蛋白转导域(ProteintransductionDomains，PTDs)，也称细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides，CPP)。利尿多肽Helicokinin是属于昆虫激肽家族的一类小分子昆虫神经肽，整个家族成员都具有类似的碳末端五肽序列Phe-Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2(FYPWGa)，这个核心5肽对于其刺激肌肉活动和利尿活动是必需的，研究表明微量昆虫激肽及其类似物可以对昆虫生理代谢造成较大的影响(Smaggheetal.AntifeedantactivityandhighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae)inducedbybiostableinsectkininanalogs，2010；Nachmanetal.BiostableandPEGpolymer-conjugatedinsectpyrokininanalogsdemonstrateantifeedantactivityandinducehighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae)，2012)，在昆虫幼体内注射l0-9M的helicokininI即可在很大程度上促进其过度排泄，进而导致昆虫死亡(Seinscheetal.，2000)。本专利技术融合基因，将蛋白转导域TAT连接入利尿多肽HKI序列，借助TAT的高效跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道系统内膜进入体内位点，确保利尿多肽序列在体内运送过程中稳定发挥作用，使棉铃虫过度排泄，导致死亡。本专利技术融合基因的制备方法采用固相亚磷酰胺三酯法合成融合基因，接枝成功率高，基因纯度高，操作简便，适于工业化推广应用。本专利技术融合基因表达载体，将融合基因构建于植物表达载体pBⅠ121中，由35S启动子驱动表达，该融合基因遗传转化进入植株后，在植株内高效表达，棉铃虫取食本专利技术融合基因表达载体遗传转化的转基因植株后3龄棉铃虫幼虫体重增幅明显减少，死亡率高。本专利技术融合基因表达载体的构建方法，工艺过程简单，便于操作实现，适于工业化推广应用。本专利技术融合基因工程菌，将融合基因表达载体转化入宿主，形成带有融合基因的菌体，采用本专利技术融合基因工程菌浸染待发芽植株，实现融合基因遗传转化植株，培育出转基因抗虫植株，融合基因在转基因植株中高效表达，棉铃虫取食植株后，使融合基因进入棉铃虫体内，其中的利尿多肽HKI基因在棉铃虫体内发挥作用，致使棉铃虫过度排泄而死亡，最终实现防治棉铃虫的目的。附图说明图1为烟草组织再生及最适卡那霉素筛选再生；a为分化初期叶盘；b为最适分化培养；c为再生烟草组培苗生根；d为烟草分化受到卡那霉素完全抑制；e为抗性芽的卡那霉素筛选；f为转基因烟草盆栽开花；图2为不同烟草植株中融合基因表达RT-PCR分析；其中1和2为实施例1不同批次培育的转基因烟草植株；3为野生烟草植株；TAT-HKI代表融合基因。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1本实施例融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本实施例融合基因在DNA合成仪上进行，其制备方法操作步骤如下：1)将利尿激肽核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种融合基因表达载体，其特征在于，包含有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。3.一种如权利要求2所述的融合基因表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1）PCR扩增如权利要求1所述的融合基因，得融合基因扩增片段；2）将pBⅠ121质粒和步骤1）制备的融合基因扩增片段酶切后，进行连接，得连接产物；3）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆载体，提取质粒，酶切和测序结果正确的质粒命名为pBI121-TAT-HKI，即为所述的融合基因表达载体。4.如权利要求3所述的融合基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤2）中酶切为BamHⅠ/SacⅠ双酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洲，李永丽，源春彦，吴建，李云祥，李晓斌，蒋路平，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41