一株高产L‑亮氨酸工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高产L‑亮氨酸工程菌及其应用。本发明专利技术提供了制备重组菌的方法，包括如下步骤：包括如下步骤：将α‑异丙基苹果酸合成酶突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述α‑异丙基苹果酸合成酶突变体为将α‑异丙基苹果酸合成酶第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸和第499位亮氨酸突变为缬氨酸得到的酶。本发明专利技术的高产L‑亮氨酸的工程菌，特别是谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum MD0032具有比目前国内生产菌株更高的L‑亮氨酸产酸率，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的L‑亮氨酸的生产菌株。

【技术实现步骤摘要】
一株高产L-亮氨酸工程菌及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一株高产L-亮氨酸工程菌及其应用。
技术介绍
L-亮氨酸与L-异亮氨酸(L-isoleucine)、L-缬氨酸(L-valine)的分子结构中含有一个甲基侧链，而被称为支链氨基酸(branchedchainaminoacids，BCAA)。L-亮氨酸作为人体必需的八种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，但体内无法自身合成。因此，L-亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值，而且随着对L-亮氨酸功能的不断开发，其应用领域正逐渐扩大，市场也在持续攀升。目前，L-亮氨酸的生产方法主要以发酵法生产为主导，其中，发酵法生产L-亮氨酸以日本企业占主导地位，其中尤以日本味之素公司为主，其在L-亮氨酸产量和品质均具有明显优势，大罐产酸能力达30-35g/L，糖酸转化率为22-28％，并可达70％以上的提取率，合计年产量400-500吨。迄今为止，工业化L-亮氨酸生产菌主要通过传统诱变筛选获得的，这种经典育种方法虽可获得L-亮氨酸相对高产的优良菌株，但是该法也会引入有害突变，使目标菌株生长缓慢，杂酸增多。另外，这种方式工作量大，周期长，很难在短期内进一步提高目标物产量。为了克服这些问题，理性化代谢工程育种正成为L-亮氨酸高产菌株获得的主要方式，也是L-亮氨酸高产菌株的育种趋势。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备重组菌的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将α-异丙基苹果酸合成酶(2-isopropylmalatesynthase，IPMS)突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体为仅将α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸、第499位亮氨酸突变为缬氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；其与α-异丙基苹果酸合成酶比，仅是第494、497、499这3个位置的氨基酸不同，其他氨基酸残基均相同。所述α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列为序列表中序列7；所述目的菌为失活苏氨酸脱水酶编码基因、丙氨酸转氨酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因、D-泛酸合成酶编码基因和亮氨酸合成调节子编码基因活性的谷氨酸棒杆菌突变菌。上述方法中，所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。上述方法中，所述目的菌按照包括如下步骤的方法制备：将谷氨酸棒杆菌基因组中的苏氨酸脱水酶编码基因替换为苏氨酸脱水酶编码基因突变基因ΔilvA、丙氨酸转氨酶编码基因替换为丙氨酸转氨酶编码基因突变基因ΔalaT、乳酸脱氢酶编码基因替换为乳酸脱氢酶编码基因突变基因Δldh、D-泛酸合成酶编码基因替换为D-泛酸合成酶编码基因突变基因ΔpanBC和亮氨酸合成调节子编码基因替换为亮氨酸合成调节子编码基因突变基因ΔltbR，得到的谷氨酸棒杆菌突变菌；所述ΔilvA的核苷酸序列为序列表中序列2；所述ΔalaT的核苷酸序列为序列表中序列3；所述Δldh的核苷酸序列为序列表中序列4；所述ΔpanBC的核苷酸序列为序列表中序列5；所述ΔltbR的核苷酸序列为序列表中序列6。上述方法中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。由上述的方法制备的重组菌也是本专利技术保护的范围。上述重组菌为谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumMD0032CCTCCNO:CCTCCM2014620。上述重组菌在制备L-亮氨酸中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种制备L-亮氨酸的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：发酵上述重组菌，收集发酵产物上清液，即得到L-亮氨酸。上述方法中，所述发酵条件为在发酵培养基中28-31℃、200-230r/min振荡培养15-55小时；或所述发酵条件为在发酵培养基中28-31℃、培养45-55小时，其使所述发酵过程中发酵体系中的溶氧量为25-45％，葡萄糖含量为0.3-0.7g/100mL。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)MD0032简称谷氨酸棒杆菌MD0032，已于2014年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNO:M2014620，分类命名为CorynebacteriumglutamicumMD0032。本专利技术的实验证明，本专利技术的高产L-亮氨酸的工程菌，特别是谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumMD0032具有比目前国内生产菌株更高的L-亮氨酸产酸率，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的L-亮氨酸的生产菌株。试验证明，本专利技术的L-亮氨酸工程菌株，30L发酵罐发酵40h，产酸率达40.5g/L，处于国内领先水平。附图说明图1为重组质粒pZ8-1-leuA*的结构示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)获自美国模式培养物集存库(http://www.atcc.org/，简称ATCC)，ATCC编号为13032，简称谷氨酸棒杆菌13032。实施例1、工程菌的构建一、外源高效表达leuA*重组载体的构建1、leuA基因的克隆及定点突变1)、以谷氨酸棒杆菌13032的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(leuA基因片段)。F1:5’-GAATTCATGCCAGTTAACCGCTACATGCCT-3’；R1:5’-GTCGACTTAAACGCCGCCAGCCAGGAC-3’。其中，F1带有EcoRI酶切位点，R1带有SalI酶切位点(上述引物的划线部分序列)。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、59℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，30个循环；72℃反应10分钟，4℃保温。2)、回收步骤1)的PCR扩增产物T-A克隆连接至SimplepMD-18T克隆载体(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，得到克隆质粒pMDleuA。3)、以步骤1)的重组质粒pMDleuA为模板，用F2和R2引物进行PCR扩增(将leuA基因片段进行定点突变，将定点突变后的基因命名为leuA*基因)，得到PCR扩增产物(模板与突变后的环状质粒的混合物)。F2:5’-ACGTCACCGTCGATGGCCCGGCAACGCCCATG-3’；R2:5’-GGCCATCGACGGTGACGTCCTTGCCGTTGT-3’。其中引物中的划线部分为互补序列，方框中的序列为突变选择点。4)、将步骤3)的PCR扩增产物用DPNⅠ酶处理1小时(去除模板)，得到重组质粒pMDleuA*。leuA*基因与野生型leuA基因的差异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：将α‑异丙基苹果酸合成酶突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述α‑异丙基苹果酸合成酶突变体为仅将α‑异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸、第499位亮氨酸突变为缬氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；所述α‑异丙基苹果酸合成酶的氨基酸序列为序列表中序列7；所述目的菌为失活苏氨酸脱水酶编码基因、丙氨酸转氨酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因、D‑泛酸合成酶编码基因和亮氨酸合成调节子编码基因活性的谷氨酸棒杆菌突变菌。

【技术特征摘要】
1.一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：将α-异丙基苹果酸合成酶突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体为仅将α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸、第499位亮氨酸突变为缬氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；所述α-异丙基苹果酸合成酶的氨基酸序列为序列表中序列7；所述目的菌为失活苏氨酸脱水酶编码基因、丙氨酸转氨酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因、D-泛酸合成酶编码基因和亮氨酸合成调节子编码基因活性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的菌按照包括如下步骤的方法制备：将谷氨酸棒杆菌基因组中的苏氨酸脱水酶编码基因替换为苏氨酸脱水酶编码基因突变基因ΔilvA、丙氨酸转氨酶编码基因替换为丙氨酸转氨酶编码基因突变基因ΔalaT、乳酸脱氢酶编...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄钦耿，黄建忠，梁玲，翁雪清，吴伟斌，黄祥峰，施巧琴，吴松刚，
申请(专利权)人：福建师范大学，福建省麦丹生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35