生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术的基因工程菌是真氧罗氏菌的基因缺失株或将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入真氧罗氏菌或真氧罗氏菌的基因缺失株中得到的；所述真氧罗氏菌的基因缺失株是将真氧罗氏菌的2-甲基柠檬酸合酶-1的编码基因和2-甲基柠檬酸合酶-2的编码基因中至少一个缺失得到的。利用本发明专利技术所构建的重组菌生产聚羟基丁酸－戊酸酯，具有以下优点：菌株安全，原料相对低廉，发酵过程容易控制，易于规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
由于塑料工业对石油的依赖性以及塑料废弃物对环境的污染的严重性，迫使人们去寻找能替代化工塑料的环保的可持续发展的材料。聚-3-羟基丁酸酯(以下简称聚羟基丁酸酯，PHB)是基于生物基生产并可以被生物降解的高分子材料，其性能类似塑料。但是PHB性脆，后处理加工有一定的难度，若在PHB中掺入3-羟基戊酸(3HV)组分，得到的聚-3-羟基丁酸共聚3-羟基戊酸酯(以下简称聚羟基丁酸－戊酸酯，PHBV)可以使材料的性能获得改善，硬度、强度、熔点均下降，但分解温度不降，这更利于拓宽产品的应用范围。PHBV可用于组织和器官修复的支架平台，缓释药物的外包装，骨再生引导膜，构建心脏生物瓣膜，医用纺织品，可降解包装材料和吸附材料等等。目前规模化生产PHBV时使用的唯一生产用菌株是真养罗氏菌突变株，但需要在培养时添加丙酸(盐)或戊酸(盐)。丙酸(盐)合成丙酰辅酶A，丙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成戊酰辅酶A，是合成3-羟基戊酸(3HV)的直接前体物，戊酸(盐)可以直接合成戊酰辅酶A。而丙酸(盐)或戊酸(盐)有细胞毒性，且价格较贵。因此，现有技术生产PHBV时需要严格控制丙酸(盐)或戊酸(盐)的流加过程，既达到一定的细胞量，又能够满足丙酰辅酶A合成的需要。现有技术生产PHBV的控制过程复杂且增加了生产成本，使应用受限。近些年来，研究人员利用基因工程技术改造菌株，但菌株的性能远达不到实现商业化生产的要求，且宿主菌或为致病菌。专利技术内容本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌是将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌Ralstoniaeutropha得到的。上述重组菌中，所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7。上述重组菌中，所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC1基因，或者通过插入灭活prpC1基因，还可以通过诱变获得prpC1基因缺失的菌株；所述Rem-3的具体获得方法是：(1)将如序列表中序列3所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1；(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1载体转化E.coliS17-1，得到的重组菌记作ΔprpC1pJQ200/S17-1，作为供体菌；(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC1pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，使Rem-1中的prpC1基因缺失，得到的重组菌即为所述Rem-3。上述重组菌中，所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC2基因，或者通过插入灭活prpC2基因，还可以通过诱变获得prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-5的具体获得方法是：(1)将如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2；(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2载体转化E.coliS17-1，得到的重组菌记作ΔprpC2pJQ200/S17-1，作为供体菌；(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC2pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，得到prpC2基因缺失的Rem-1记作ΔprpC2/Rem-1，即所述Rem-5。上述重组菌中，所述Rem-7是真氧罗氏菌Rem-1缺失所述2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC1和prpC2基因，或者通过插入灭活prpC1和prpC2基因，还可以通过诱变获得prpC1和prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-7的具体获得方法是：(1)将如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2；(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2载体转化E.coliS17-1，得到的重组菌记作ΔprpC2pJQ200/S17-1，作为供体菌；(3)以所述Rem-3为受体菌，将所述供体菌ΔprpC2pJQ200/S17-1与受体菌Rem-3进行接合转移，得到prpC2基因缺失的Rem-3记作ΔprpC2/Rem-3，即所述Rem-7。上述重组菌中，所述2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-1的编码基因序列如序列表序列1中自5′端第878-2035位核苷酸分子所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-2的编码基因序列如序列表中序列4中自5′端第1032-2229位核苷酸分子所示。上述重组菌中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、所述GTP激酶的编码基因argK和所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG通过重组表达载体pZMwf导入所述宿主真氧罗氏菌。上述重组菌中，所述重组表达载体pZMwf的构建方法包括如下步骤：将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中，得到的重组载体记作pZMwf。上述重组菌中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。本专利技术的另一个目的是提供一种含有甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG的重组表达载体。本专利技术提供的含有甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG的重组表达载体是将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中得到的。上述重组表达载体中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。本专利技术还有一个目的是提供上述所述的Rem-3或上述所述的Rem-5或上述所述的Rem-7。上述所述的重组菌或上述所述的重组表达载体或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在生产聚羟基丁酸－戊酸酯中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述所述的重组菌或上述所述的重组表达载体或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV组分含量中的应用也属于本专利技术的保护本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌，包括将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌Ralstonia eutropha，得到所述重组菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌，将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌(Ralstoniaeutropha)，得到所述重组菌；所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7；所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述真氧罗氏菌Rem-1为真氧产碱杆菌65-7；所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述Rem-7是真氧罗氏菌Rem-1缺失所述2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁久元，张英姿，刘桂明，翁维琦，刘双江，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11