用于检测人HLA-B*1301基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供用于人HLA-B*1301等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测人白细胞抗原HLA-B*1301等位基因。

【技术实现步骤摘要】
用于检测人HLA-B*1301基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒 和方法
本专利技术属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于HLA等位基因型 HLA-B*1301等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。
技术介绍
人类白细胞抗原（HLA)是一组位于第6号染色体上的基因，是迄今已知基因中等 位基因多态性最高的基因复合体，全世界已发现超过2700多种等位基因，虽然其中多数等 位基因非常罕见。HLA基因是人类最复杂的遗传多态性系统，其多态性分布存在明显的族群 特征。研究表明，HLA-B*1301等位基因与药物氨苯砜导致的氨苯砜综合症存在着很强的 相关性。 氨苯砜为砜类抑菌剂，对麻风杆菌有较强的抑菌作用。其作用机制与磺胺类药物 相似，作用于细菌的二氢叶酸合成酶，干扰叶酸的合成。氨苯砜已经拓展到治疗艾滋病并发 症、疟疾、自身免疫性大疱病、无菌性脓疱病、血管炎、痤疮、风湿性关节炎、急性缺血性脑中 风等疾病。氨苯砜综合症是氨苯砜治疗引起的严重副作用，表现为患者在服用氨苯砜后4-6 周后，会突然发生高烧、皮疹、浅表淋巴结肿大、内脏器官受累等药物超敏综合症状，严重 者可出现器官功能衰竭，死亡率高达11%_13%，且具有不可预测性。 研究表明，HLA-B*1301等位基因携带者在使用氨苯砜后发生重症药物不良反应 的风险是非携带者的37. 5倍；而有两个拷贝的HLA-B*1301风险等位基因，风险增长 到110. 8倍。因此HLA-B*1301等位基因可以作为氨苯砜综合症的风险位点。检测 HLA-B*1301对减少药物不良反应，提高治疗效果有着重要意义。 HLA等位基因有2700多种，分为A、B、C、DRB等基因族。中国汉人中，HLA-B等位 基因大概有150种左右，HLA-B*1301的携带率达飞％，并呈区域性差异。等位基因间的差异 由多个编码氨基酸的SNP位点组成。 目前，国内外对HLA-B*1301等位基因进行分析，大多采用PCR-SSCP、测序法（SBT) 和荧光PCR法。测序法最为准备，但需要通过专业软件对测序结果进行分析，检测分析周期 长。PCR-SSCP法是一种经典的方法，通过几对HLA-B*1301特异性引物扩增DNA并通过电泳 结果来分析，污染风险大，周期长，不适合临床应用。现行的荧光PCR法，采用染料对扩增的 特异片段产生信号，特异性较弱，而且无法进行PCR反应内控。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术检测HLA_B*1301等位基因时价格昂贵、周期长、低效率、数 据分析繁琐等不足，提供了一种基于Taqman实时荧光定量PCR技术平台的HLA_B*1301等 位基因检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人HLA-B*1301等位基因。本 方法针对临床检测的要求，引入PCR反应内控，保证检测反应的真实性和准确性。本专利技术快 速、成本低，具有广泛推广价值。 为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是： 一种用于检测人HLA-B* 1301等位基因的检测引物及其相应探针，根据HLA-B* 1301特 异的等位基因多态性设计，序列如下所示： 正向引物： HLA-B*1301 F: 5, - GGGCCAGGGTCTCACATCA-3'（ SEQ ID No. 1); 反向引物： HLA-B*1301 R: 5' - CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3'（ SEQ ID No.2) 荧光探针： TM-HLA-B*1301: 5' 荧光基团-CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG -3' 淬灭基团（SEQ ID No. 3)。 本专利技术还提供了一种用于检测人HLA-B*1301等位基因的内控引物对及相应荧光 探针，序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5'-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3'（ SEQ ID No.4); 反向引物：GAPDH R: 5'-TAGCACTCACCATGTAGITGAG-3'（ SEQ ID No.5); 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3' 淬灭基团（SEQ ID No.6)。 上述检测人HLA-B*1301等位基因的探针和内控引物对应的荧光探针5'端的荧 光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX 或R〇X，3'端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5'端连有的荧光 基团为FAM，3'端连有的淬灭基团为Dabcyl ;内控荧光探针的5'端连有的荧光基团为R0X， 3'端连有的淬灭基团为BHQ-2。 本专利技术还提供了一种用于检测人HLA-B*1301等位基因的荧光PCR试剂盒，包括本 专利技术所述检测人HLA-B*1301等位基因的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体 的说，包括检测人HLA-B*1301等位基因的PCR反应液，其中PCR反应液包含了 PCR反应必 须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检 测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下 ： (1)HLA-B*1301 PCR 反应液 HLA-B*1301 F :5' -GGGCCAGGGTCTCACATCA -3' ； HLA-B*1301 R::5' -CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3' TM-HLA- B*1301 : 5' 荧光基团-CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG-3' 淬灭基团 上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人HLA B*5801等位基因的检测引 物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如 下： 内控引物： GAPDH F: 5' - GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3' GAPDH R: 5' - TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3' 内控荧光探针： TM-GAPDH: 5' 荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC -3' 淬灭基团。 上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变 性的条件为：温度为95°C，时间为3分钟； PCR反应由第一阶段和第二阶段构成： 第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒； 第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为： 变性：温度为95°C，时间为20秒； 退火延伸：起始温度为62°C，时间为45秒；（设置荧光信号采集） 本专利技术还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测HLA-B*1301 等位基因的荧光PCR试剂盒进行HLA-B*1301等位基因检测的方法，步骤包括： (1)待测样品处理和模板提取 a. 从待检测者抽取血液样本； b. 从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测人HLA‑B*1301等位基因的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据HLA‑B*1301等位基因特异位点设计，序列如下所示：正向引物：HLA‑B*1301 F: 5’‑GGGCCAGGGTCTCACATCA ‑3’反向引物：HLA‑B*1301 R: 5’‑CACGGGCCGCCTCCCACTTGA‑3’荧光探针：TM‑HLA‑B*1301: 5’荧光基团‑ 5CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG ‑3’淬灭基团。

【技术特征摘要】
1. 一种用于检测人HLA-B*1301等位基因的检测引物及其相应探针，其特征在于所述 检测引物及探针根据HLA-B*1301等位基因特异位点设计，序列如下所示： 正向引物： HLA-B*1301 F: 5' -GGGCCAGGGTCTCACATCA -3' 反向引物： HLA-B*1301 R: 5' -CACGGGCCGCCTCCCACTTGA-3' 荧光探针： TM-HLA-B*1301: 5' 荧光基团-5CCAGGTAGGCTCTCAGCTGCTCCG -3' 淬灭基团。2. -种用于检测人HLA-B*1301等位基因的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于 所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示： 内控引物对： 正向引物：GAPDH F: 5' -GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3' 反向引物：GAPDH R: 5' -TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3,内控荧光探针： 荧光探针：TM-GAPDH: 5' 荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进，吴梦华，赵小龙，吴子侠，石亦静，
申请(专利权)人：苏州旷远生物分子技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32