本发明专利技术公开了一种快速发酵面包酵母菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过在亲本面包酵母菌株中，完全敲除葡萄糖磷酸变位酶基因PGM2，同时选用强启动子PGK1过表达H/ACA小核仁RNA(SNR84)全序列，来获得该快速发酵面包酵母菌株。所述快速发酵面包酵母菌株在不加糖面团发酵中1h CO2产气量达到818mL，较亲本菌株提高了21.2％(亲本菌株不加糖面团发酵1h CO2产气量675mL)，同时发酵时间缩短了18.0％。该面包酵母在不加糖面团中发酵能力强，满足了面食加工市场对“快速”酵母的需求，有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
: 本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的育种，尤其是一株快速发酵面包酵母及其构建方法。
技术介绍
: 现今，面食花样繁多，制作方法也多种多样，但不管采取何种制作方法，面团的发酵过程都是整个工艺中的重要步骤，它直接影响着面食产品的质量。欧美等发达国家考虑到健康因素普遍以咸面包为主食，面包普遍为不加糖或低糖(加糖量低于6%)。我国人口众多，其中有一半左右的人口以面食为主，而且大都是馒头等不加糖面团发酵类面食，据统计北方约有70%的小麦面粉用来制作馒头。 面团发酵的实质是面粉在各种酶的作用下，将各种双糖和多糖转化为可发酵的单糖，再经酵母的发酵作用转化成二氧化碳，使面团膨胀和生成其它发酵物质，使面包增加风味、面团成熟的过程。面团发酵能力是衡量面包酵母产品质量的重要指标。良好的面团起发能力可以大大缩短面团发酵周期，从而提高经济效益。 在不加糖面团中，最主要的可发酵糖是麦芽糖。麦芽糖经麦芽糖通透酶运输到细胞内经麦芽糖酶水解为两个葡萄糖分子进入糖酵解途径，供细胞利用。6-磷酸葡萄糖是糖酵解过程的第一个中间物，在继续进行各种化学反应生成CO2和H20、释放能量的同时，由葡萄糖磷酸变位酶(PGM2)转化成1-磷酸葡萄糖合成糖原，减少糖酵解途径的通量。因此，敲除葡萄糖磷酸变位酶编码基因PGM2，阻断6-磷酸葡萄糖到1-磷酸葡萄糖的转化，可以增加糖酵解途径的通量，提高有氧条件下CO2的产量，从而提高面团发酵力。 SNR84基因编码H/ACA snoRNA (小核仁RNA)。大部分H/ACA小核仁RNA参与碱基修饰，像大亚基rRNA的假尿苷化，指定rRNA中假尿苷的形成位点；小部分H/ACA小核仁RNA在剪切前体rRNA中也起到重要作用。据推测，SNR84参与到激活大亚基rRNA假尿苷化的功能，加快大亚基rRNA的成熟速率和提高大亚基rRNA的数量。当成熟的大亚基rRNA在指数生长期快速形成时，大部分相关酶的产率提高。Lee等以半乳糖为碳源，通过过表达SNR84基因提高了酿酒酵母在半乳糖中的生长及酒精产量。 目前，很多研究通过对麦芽糖代谢途径直接相关基因的改造提高麦芽糖代谢速度，从而提高面团发酵力，对麦芽糖代谢途径间接相关基因的改造或对未知的麦芽糖代谢网络调节的报道较少，同时，目前对于H/ACA小核仁RNA的研究基本上集中在理论研究，关于H/ACA小核仁RNA的应用仅有少数报道，尤其在选育快速发酵菌株中的研究更是空白。因此，本专利技术通过完全敲除PGM2编码的葡萄糖磷酸变位酶基因，同时过表达SNR84基因编码的H/ACAsnoRNA，选育快速发酵面包酵母菌株，满足酵母应用相关领域对酵母的较高要求。
技术实现思路
: 本专利技术所解决的技术问题之一是提供一株快速发酵面包酵母菌株。 所述快速发酵面包酵母菌株是在出发酵母菌株中完全敲除PGM2编码的葡萄糖磷酸变位酶，同时过表达由SNR84基因编码的H/ACA小核仁RNA全序列所得。 所述PGM2基因其Gene ID为:855131，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示；所述SNR84基因其Gene ID为:9164879，序列如核苷酸序列表中SEQ NO: 2所示。 优选的，所述出发酵母菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。 本专利技术所解决的另一个技术问题是提供一种快速发酵面包酵母菌株的构建方法，包括如下步骤: (1)PGM2基因的敲除 ①以质粒pUC6为模板，PCR扩增KanMX基因； ②将步骤(1)-①得到的PCR产物导入出发酵母菌株中，获得KanMX替代敲除PGM2的重组菌株I ; ③用pGAP质粒去除步骤(1)-②获得菌株中的KanMX基因，获得完全敲除PGM2的重组菌株2 ； (2)SNR84基因的过表达 ①以面包酵母CICC31616总DNA为模板，PCR扩增SNR84基因； ②将步骤(2)- ①得到的PCR产物连接到含有PGKl强启动子的质粒上，获得表达质粒I ; ③以表达质粒I为模板，通过PCR扩增获得SNR84基因和强启动子的连接片段； ④将步骤(2)-③获得的片段连接到带有KanMX抗性的载体上，得到表达质粒2 ； ⑤将步骤(2)-④获得的表达质粒2导入重组菌株2中，获得完全敲除PGM2同时过表达SNR84的重组菌株。 所述含有PGKl强启动子的质粒优选pUC质粒； 所述带有KanMX抗性的载体优选Y印352载体； 优选的，所述出发酵母菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。 所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC31616,是一株保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心的菌株，公众可通过购买获得。 所述重组菌株可通过上述方法构建，也可以用其他分子生物学手段获得。这些方法已有许多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版,科学出版社，1995。 本专利技术所述的面包酵母重组菌株，其在不加糖面团发酵中每小时产气较亲本菌株提高21.2%，发酵时间缩短18.0%。 有益效果: 1、本专利技术提供一种快速发酵面包酵母，满足了面食加工市场对“快速”酵母的需求。 2、本专利技术提供的快速发酵面包酵母是在保持优良基本发酵性能的前提下，在不加糖面团发酵中表现出较高的面团起发能力，从而缩短发酵时间,提高经济效益。 3、本专利技术所述的快速发酵面包酵母菌株是通过完全敲除PGM2编码的葡萄糖磷酸变位酶，同时过表达由SNR84基因编码的H/ACA小核仁RNA全序列所得，是对葡萄糖磷酸变位酶和H/ACA小核仁RNA的创造性运用，为其理论研究和应用研究开辟了新的领域。 4、选育得到的菌株对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景，必将带动我国焙烤食品行业、馒头产业和零售行业的发展。【附图说明】: 图1为Y印-KPS质粒构建过程； 图2为表达质粒Y印-KPS的PCR验证 其中:(a)中M为marker ;I为以Y印-KPS为模板，PCR扩增SNR84片段 (b)中M为marker ; I为以Y印-KPS为模板，PCR扩增片段PS ； 图3为敲除PGM2重组菌株的验证 其中:M为marker ;1为以重组菌株2的基因组为模板，PCR扩增PGM2片段；2为以出发菌CICC31616基因组为模板，PCR扩增PGM2片段；3为以重组菌株2的基因组为模板，PCR扩增KanMX片段；4为以重组菌株I的基因组为模板，PCR扩增KanMX片段 图4为完全敲除PGM2的重组菌株中过表达SNR84基因的验证 其中:M为marker ；1为以完全敲除PGM2且过表达SNR84基因重组菌株的酵母质粒为模板，PCR扩增PS片段；2为以出发菌CICC31616酵母质粒为模板，PCR扩增PS片段。 【具体实施方式】 : 下面通过具体的实施方案叙述本专利技术的一种快速发酵面包酵母菌株及其选育方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 实施例1:快速发酵面包酵母菌株的构建 (I)表达质粒Y印-KPS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株快速发酵面包酵母菌株，是在酵母出发菌株中完全敲除葡萄糖磷酸变位酶基因PGM2的同时过表达H/ACA小核仁RNA的编码基因SNR84获得。
【技术特征摘要】
1.一株快速发酵面包酵母菌株，是在酵母出发菌株中完全敲除葡萄糖磷酸变位酶基因PGM2的同时过表达H/ACA小核仁RNA的编码基因SNR84获得。2.如权利要求1所述的一株快速发酵面包酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。3.如权利要求1所述的一株快速发酵面包酵母菌株，其特征在于，所述PGM2基因其Gene ID为:855131，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ N0:1所示；所述SNR84基因其GeneID为:9164879，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO: 2所示。4.一株快速发酵面包酵母菌株的制备方法，包括以下步骤: (1)PGM2基因的敲除 ①以质粒pUC6为模板，PCR扩增KanMX基因； ②将步骤(1)-①得到的PCR产物导入酵母出发菌株中，获得KanMX替代敲除PGM2的重组菌株I ; ③用PGAP质粒去除步骤(1)-②获得菌株中的KanMX，获得完全敲除PGM2的重组菌株2； (2)SNR84基因的过 表达 ①以面包酵母CICC31616总DNA为模板，PCR扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，肖冬光，林雪，董健，柏晓雯，宋海岩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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