本发明专利技术关于一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及鉴定方法。所述的寡核苷酸探针包括片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段；以及片段长度为0至15个核苷酸的非专一性片段，其中所述专一性片段是位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段是用以连接一固相支持物。本发明专利技术还关于利用所述寡核苷酸探针的生物芯片及其用于鉴定分枝杆菌的方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术关于一种。所述的寡核苷酸探针包括片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段；以及片段长度为0至15个核苷酸的非专一性片段，其中所述专一性片段是位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段是用以连接一固相支持物。本专利技术还关于利用所述寡核苷酸探针的生物芯片及其用于鉴定分枝杆菌的方法。【专利说明】
本专利技术关于一种寡核苷酸探针,尤其是关于一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及其鉴定方法。
技术介绍
全球由结核杆菌群引起的结核病(tuberculosis)每年约有920万新案例，并造成170万人死亡。中国台湾每年亦有14，500至16，500个肺结核病例，故其被视为全世界公共卫生的大问题。分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)包括绝对致病菌、兼性致病菌及腐生菌。目前已分离出将近100种分枝杆菌,其引起的疾病主要有结核病(tuberculosis)和麻风病(leprosy),除了结核分枝杆菌复合群(MTB complex)菌种外，尚有近三十种非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobateria, NTM)会引起肺部感染及各种何机全身性或局部感染；此菌为嗜氧性(aerobic)、革兰氏阳性(Gram-positive),因其细胞壁上含丰富腊质,抹片施以抗酸性染色(acid fast stain)后在显微镜下呈红色杆状的细胞型态；菌体抗酸性的特性为分枝杆菌的初步检测依据。分枝杆菌鉴定的传统方法包括染色特征、菌落型态、生理及生化特性等。分枝杆菌依生长速度区分为快速(七天以内可形成菌落)和慢速(七天以上形成菌落)生长菌，在此之后以传统方法鉴定还要花费2-4周不等，这也是造成分枝杆菌感染患者在诊疗上最大的困扰。结核菌的临床诊断上，除了以抗酸性染色进行快速筛选外，分枝杆菌的培养与传统鉴定方法仍是临床鉴定的黄金标准，然而抗酸性染色结果虽然可以在24小时内得知，但染色的侦测极限与阳性预测率(positive predictive rate, PPV)均不到80%,而进行传统鉴定则需花费2-4周的时间，使得分子检测有了发展的空间。近年来，分子生物学发展快速，除了学术研究外，也开始应用在临床病原微生物检验上。因为分子生物技术拥有一些传统方法无法达到的特性，如，微量操作、快速、专一性与再现性高、可区分混合菌种等，让分子生物在各种鉴定方法中突显出优势的一面。随着分子技术的进步，核酸扩增反应(NAAT)与DNA杂交反应的技术可提升检测的侦测极限与准确性，然而目前进行分子检测的检体来源多来自做完抗酸性染色及接种培养后剩下的检体，其所含的菌数较低，当抗酸性染色的价数小于一价，或来自经过药物治疗的病患检体，甚至检体中含有的干扰物质，都会造成伪阴性的误判。另外，若直接以分子检测对消化去污染后的痰液或血液检体进行鉴定，将无法判断检体中的是为活菌或死菌，使得检验及医疗人员对其结果产生疑虑。所有细菌的16S rRNA长度约为1.5Kb。在此长度中有高度保留区(highlyconserved region)以及因细菌种类的不同而发生变化的区域。相对于16S rRNA, 23S rRNA被定序的种类较少，其最主要原因是23S rRNA比较大，约为3Kb。而16S与23S核糖体核酸基因间间隔区(intergenic spacer region, ITS)的长度和序列在不同菌种间变化较大，其长度约在 60 至 1，529bp 之间，故 Giirtler 等人(Giirtler and Stanisich, 1996)认为此间隔区可用来作为鉴定菌株的工具。16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列除了少数几个菌种外，在种与种间(interspecies)的相似度不高,但同种内(intraspecies)的相似度却极高，而16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列很相似的菌种，通常可利用序列指纹(fingerprint sequence)加以辨识。相较于16S rRNA序列，16S与23S核糖体核酸基因间间隔区在长度上较短，仅需一次定序即可得到完整的序列(16S rRNA通常需要两次以上的定序)，且序列在种间的差异度(divergence)远大于16S rRNA(因为部份相近菌种相似度大于 99% ),因此 Kawamura 与 Patel 等人(Kawamuraet al., 1995 ；Patel et al., 1998)认为利用16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列有利于菌株的鉴定。一般常用的分子检验技术为核酸扩增技术(nucleic acid amplificationtechniques ;NAAT),尤其以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ;PCR)最为被广泛利用，而近年来生物芯片(biochip)的设计更是蓬勃发展，这类产品包括德国HainLifescience公司的Genotype CM/AS、中国台湾金车公司的人类乳突瘤病毒基因定型点墨EASYChip HPV Blot与中国台湾晶宇生物科技的结核分枝杆菌群检验试剂试剂盒DR.MTBCScreenTM IVD Kit。生物芯片又称为DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),乃衍生自北方墨点法(Northern blotting)或南方墨点法(Southern blotting)的一种应用技术，其原理是将与目标基因互补的单链DNA片段(又称为探针；pr0be)点制在载体，并以化学键结或紫外光方法固定于载体，载体材质可为玻璃片、陶瓷片、硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane)或尼龙膜(nylon membrane);检测时通过PCR扩增目标基因片段，经过杂交反应(hybridization)与载体上的探针结合后，以酶呈色法显现讯号，再配合利用特殊的判读机器减少人为判读的误差。目前，采用寡核苷酸芯片而成的生物芯片来鉴定分枝杆菌为主要发展趋势。所谓的寡核苷酸是采用合成的固定长度的具基因专一性序列的单链寡核苷酸代替PCR合成的DNA双链探针，并将之固定于固相支持物上。此一微小的变动却使寡核苷酸芯片比传统的cDNA芯片具有卓越的优点，例如，序列经过优化，减少非专一性杂交，能有效区分具有同源类似序列的基因；减少二级结构的发生；杂交温度均一，提高杂交效率；合成产物浓度均一，避免因待测样品浓度差异而造成点样量差异；无需扩增，防止因扩增失败影响鉴定结果。传统的cDNA芯片的固定方式可以通过简单且易于操作的紫外线交互链接反应(UVcross linkage)而固定于尼龙膜上。除前述专一'I"生序列之外，一般导入长度为15至20nt的聚合的胸腺嘧啶核苷酸尾端(poly T tail)作为用于将寡核苷酸探针固定于固相支持物的非专一性片段。又，于中国台湾专利申请1309262中提出，较短的寡核苷酸探针无法有效与固相支持物结合，因此其提出以长度为30至IOOnt的非专一性片段，可加强探针与固相支持物间的结合。然而，专利技术人经由密集的实验发现，过长的非专一性片段将造成探针无法牢固地固定于支持物上，进而使得鉴定结果不准确甚至无法呈现任合杂交本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针，其包含：片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段；及片段长度为0至30个核苷酸的非专一性片段；其中所述专一性片段位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段连接至一固相支持物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡岳廷，何耿德，林函颐，杨士杰，谢贤修，
申请(专利权)人：启新生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：台湾;71
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