一种功能型基因载体及DNA/载体复合物制造技术

本发明专利技术公开了一种功能型基因载体，它由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为1～8:1～4:1～12，本发明专利技术还公开了一种DNA/载体复合物，该复合物具有低毒、高效、稳定、制备过程简便、条件温和等优点，在生物医学领域，如基因/药物传递系统方面具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种功能型基因载体及DNA/载体复合物
本专利技术涉及生物医用载体材料领域，具体涉及一种功能型基因载体，本专利技术还涉及一种DNA/载体复合物及其制备方法。
技术介绍
随着人类在生物医学领域探索步伐的加快，对于以传统化学药物手段治疗却收效甚微的部分疑难杂症，也逐步发现了新的突破性方法，而基因治疗正是其中一项重要的理论创新与技术创新。在基因治疗过程中，通过各种载体将功能基因运送到靶细胞或靶组织以修复受损/缺失基因，从而达到治愈疾病的目的。其中，构建和筛选合适的载体以实现基因的有效传递，对于基因治疗的成功至关重要。用于基因传递的载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。尽管病毒载体具有天然的高效转染能力，但其治疗过程中的生物安全问题仍不容忽视。因此，在基因载体研究领域，目前的相关热点主要集中于诸如树枝状大分子、阳离子聚合物、阳离子脂质体和多肽等有机类非病毒载体，以及碳酸钙和硅基材料等无机类非病毒载体。在应用安全得到保障的前提下，如何提高上述非病毒载体的转染效率，以使其能与病毒载体的转染能力相媲美，一直都是广大研究者的关注重点。其中，碳酸钙作为最常用的无机类非病毒载体材料之一，尽管具备良好的生物相容性和生物可降解性，并且可以较好的包载DNA，实现细胞水平的转染。但在制备时，由于钙离子和碳酸根离子混合后生成载体的过程缺乏调控，容易导致载体粒径过大，从而降低转染效率。同时，也影响了该载体制备过程的可操作性与重现性。天然高分子由于来源广泛，生物相容性较好，也越来越多的被应用于药物和基因载体的构建，如壳聚糖和淀粉等。海藻酸作为一种常见易得的天然高分子，已开发得到的载体包括微球和凝胶等多种形态，而且还可通过静电作用或化学修饰手段赋予载体更多有利的特性，是一类重要的生物医用有机材料。此外，具有优异生物相容性的多肽也是一类常用的基因载体材料。特定氨基酸序列的有序组合能够为多肽载体基因转染过程的各阶段(载体的基因包载、细胞膜受体靶向、跨膜入胞、内含体逃逸与核定位等)提供有效的帮助，使多肽成为了目前载体材料研究的热点之一。本专利技术优选有机和无机非病毒载体材料进行结合，开发得到一种低毒、高效、稳定、制备简便的有机/无机混合基因载体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述碳酸钙载体制备技术中的不足，提供一种功能型基因载体，该基因载体以有机和无机非病毒载体材料为基础，具有毒性低、稳定性好、转染效率高、制备简便等优点。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种功能型基因载体，它由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为1～8:1～4:1～12。作为优选，海藻酸钠的分子量为50～150kDa。进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术其次提供了一种DNA/载体复合物，它由以上所述的功能型基因载体和质粒DNA组成。优选地，所述功能型基因载体与质粒DNA的质量比为1～150:1。本专利技术再次还提供一种制备所述DNA/载体复合物的方法，它包括以下步骤：(1)配制氯化钙和质粒DNA的混合水溶液；(2)配制多肽、海藻酸钠和碳酸钠的混合水溶液；(3)将步骤(1)溶液滴加至步骤(2)溶液中，使氯化钙与碳酸钠发生反应，并形成Zeta电位为-10～50mV，粒径约为200～700nm的DNA/载体复合物。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术通过向无机载体材料碳酸钙中引入海藻酸钠，使制备得到的基因载体粒径得到控制，减少粒子聚集增大的发生，提高载体复合物进入细胞的能力，促进细胞的转染；同时，还能减弱内皮网状系统对载体复合物的吞噬，延长其在生物体内的循环时间，从而增强载体复合物的稳定性，提升基因传递的效能。(2)本专利技术通过向无机载体材料碳酸钙中引入含有核定位序列(PKKKRKV)、内含体逃逸序列(H7)和穿膜序列(R8)的功能型多肽，使制备得到的载体具备克服基因跨膜转运、内含体逃逸和进入细胞核等障碍的能力，进一步改善转染效率。(3)本专利技术向无机载体材料碳酸钙中引入的海藻酸钠和多肽，均为生物相容性良好的有机载体材料，能够在不影响正常生理条件的情况下，提高对细胞的转染效率。(4)本专利技术结合了无机材料碳酸钙、有机材料海藻酸钠与多肽作为基因载体的优点，制备得到的有机/无机混合基因载体具有优秀的转染能力，制备过程简单，条件温和，易于操作。附图说明图1为实施例1、实施例2和实施例3制备得到的DNA/载体复合物对HepG2细胞、COS-7细胞和HeLa细胞的转染效果图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明，实施例中涉及到的原料或试剂均为普通市售产品。实施例1一种功能型基因载体，由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为2:1:3，所述海藻酸钠的分子量为100kDa，所述多肽为PKKKRKVH7R8，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。一种DNA/载体复合物，由功能型基因载体和质粒DNA(荧光素酶质粒pGL-3)组成，所述功能型基因载体与质粒DNA的质量比为30:1。所述DNA/载体复合物的制备方法如下：(1)配制100mg/mL氯化钙和100μg/mL质粒DNA(荧光素酶质粒pGL-3)的混合水溶液1mL；(2)配制1500μg/mL多肽、500μg/mL海藻酸钠和1.06mg/mL碳酸钠的混合水溶液1mL；(3)将步骤(1)溶液滴加至步骤(2)溶液中，使氯化钙与碳酸钠发生反应，并形成DNA/载体复合物的混悬水溶液。采用动态光散射仪对实施例1制备得到的DNA/载体复合物进行电位和粒径分析。测定结果表明，复合物的Zeta电位为25mV，平均粒径为271nm，分散性良好。实施例2一种功能型基因载体，由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为4:2:5，所述海藻酸钠的分子量为50kDa，所述多肽为PKKKRKVH7R8。一种DNA/载体复合物，由功能型基因载体和质粒DNA(荧光素酶质粒pGL-3)组成，所述功能型基因载体与质粒DNA的质量比为110:1。所述DNA/载体复合物的制备方法如下：(1)配制200mg/mL氯化钙和50μg/mL质粒DNA的混合水溶液1mL；(2)配制2500μg/mL多肽、1000μg/mL海藻酸钠和2.12mg/mL碳酸钠的混合水溶液1mL；(3)将步骤(1)溶液滴加至步骤(2)溶液中，使氯化钙与碳酸钠发生反应，并形成DNA/载体复合物的混悬水溶液。测定结果表明，复合物Zeta电位为39mV，平均粒径为409nm。实施例3一种功能型基因载体，由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为1:1:1，所述海藻酸钠的分子量为150kDa，所述多肽为PKKKRKVH7R8。一种DNA/载体复合物，由功能型基因载体和质粒DNA(荧光素酶质粒pGL-3)组成，所述功能型基因载体与质粒DNA的质量比为2:1。所述DNA/载体复合物的制备方法如下：(1)配制20mg/mL氯化钙和300μg/mL质粒DNA的混合水溶液1mL；(2)配制200μg/mL多肽、200μg/mL海藻酸钠和0.212mg/mL碳酸钠的混合水溶液1mL；(3)将步骤(1)溶液滴加至步骤(2)溶液中，使氯化钙与碳酸钠发生反应，并形成DNA/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能型基因载体，其特征在于由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为1～8:1～4:1～12。

【技术特征摘要】
1.一种功能型基因载体，其特征在于由碳酸钙、海藻酸钠和多肽组成，所述碳酸钙、海藻酸钠和多肽的质量比为1～8:1～4:1～12。2.如权利要求1所述的功能型基因载体，其特征在于：所述海藻酸钠的分子量为50～150kDa。3.如权利要求1所述的功能型基因载体，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。4.一种DNA/载体复合物，其特征在于：由权利要求1～3任何一项所述的功能型基因载体和质粒DNA组成。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿玮，张先正，曾旋，谢书宇，潘源虎，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42