靶向穿膜肽基因载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向穿膜肽基因载体及其应用，靶向穿膜肽基因载体的氨基酸序列为：REDV‑Gm‑YGRKKRRQRRR‑Gn‑PKKKRKV，其中：m＝1‑4,n＝1‑4。本发明专利技术的靶向穿膜肽基因载体，生物相容性更好，对内皮细胞基本无毒性。靶向穿膜肽基因载体携带基因选择性地进入内皮细胞，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，有利于血管的形成。本发明专利技术的靶向穿膜肽基因载体同时具有穿膜肽和核定位信号的功能，有利于携带基因高效地进入细胞和细胞核，从而大大提高基因递送效果，达到基因治疗的目的。本发明专利技术提高基因递送效果，促进缺陷血管组织处血管生成。

Targeted membrane peptide gene vector and its application

The invention discloses a targeted peptide gene vector and its application, targeting the amino acid sequence of transmembrane peptide gene vector: REDV Gm YGRKKRRQRRR Gn PKKKRKV, including: M = 1 4, n = 1 4. The target transmembrane peptide gene carrier of the invention has better biocompatibility and non-toxic to endothelial cells. Targeting membrane peptide gene carrier carries genes selectively into endothelial cells, thus promoting the proliferation and migration of endothelial cells, which is beneficial to the formation of blood vessels. The target penetrating peptide gene carrier of the invention has the functions of penetrating peptides and nuclear location signals simultaneously, and is beneficial for carrying genes into cells and nuclei efficiently, thereby greatly improving the effect of gene delivery and achieving the goal of gene therapy. The invention improves the effect of gene delivery and promotes the angiogenesis of defective vascular tissue.

【技术实现步骤摘要】
靶向穿膜肽基因载体及其应用
本专利技术属于分子生物领域，涉及一种靶向穿膜肽基因载体及其应用。
技术介绍
目前，心血管疾病日益盛行。由于临床治疗效果不佳以及巨额的治疗费用，心血管类疾病仍是全球造成死亡的主要原因之一。目前，治疗先天和后天性心血管疾病的方法中，基因治疗引起了越来越多研究者的重视。随着心力衰竭及相关心血管疾病的病理生理学分子途径的识别，基因治疗的预临床试验在小型和大型动物模型上纷纷展开，并逐步走向临床，然而，最初的临床效果并没有达到预期的目标。病毒载体因其安全问题备受争议。非病毒基因载体很好地避免了病毒载体的这一问题，但是细胞毒性高、选择性差、细胞摄取效率低、进细胞核困难、转染效率差、基因表达水平低等都是基因载体携带治疗基因无法在目标组织或细胞累积的主要问题。有效的基因递送系统是基因治疗的关键，如何获得安全高效的基因载体是非常重要的研究内容。近年来，阳离子聚合物基因载体因其易于制备修饰、高转染效率等特点，受到了人们广泛的关注。但是由于其较高的电荷密度，在具有高的细胞转染效率的同时也具有很高的细胞毒性。因此，如何获得低毒高效的靶向性基因载体仍然是研究者们的努力方向。基因递送过程是非常复杂的，需要跨越多层屏障，如何高效的穿过细胞膜、有效的从内涵体逃逸并高效地进入细胞核，仍然是设计基因载体的重点。基于穿膜肽的基因载体具有很高的生物相容性且具备特殊的穿膜效果，在基因载体设计方面具有很大的发展潜力，但是特异性的缺乏使得其研究也受到了限制。因此，安全高效特异性基因载体的设计仍面临着很大的挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有很好的生物相容性、高效的基因递送效果及对内皮细胞靶向性的靶向穿膜肽基因载体。本专利技术的第二个目的是提供上述靶向穿膜肽基因载体的应用。本专利技术的第三个目的是提供第二种靶向穿膜肽基因载体。本专利技术的第四个目的是提供第二种靶向穿膜肽基因载体的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种靶向穿膜肽基因载体，所述载体的氨基酸序列为：REDV-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV，用SEQIDNO.1所示；上述靶向穿膜肽基因载体递送基因的应用。第二种靶向穿膜肽基因载体，所述载体的氨基酸序列为：REDV-Gm-YGRKKRRQRRR-Gn-PKKKRKV，其中：m＝1-4,n＝1-4。优选地：m＝4,n＝4。当m＝1,n＝1时，REDV-Gm-YGRKKRRQRRR-Gn-PKKKRKV用SEQIDNO.2所示；当m＝4,n＝4，REDV-Gm-YGRKKRRQRRR-Gn-PKKKRKV用SEQIDNO.3所示；上述第二种靶向穿膜肽基因载体靶及优选向穿膜肽基因载体递送基因的应用。本专利技术的优点是：(1)本专利技术的靶向穿膜肽基因载体，采用多肽作为基因载体，生物相容性更好，对内皮细胞基本无毒性。(2)靶向穿膜肽基因载体携带基因选择性地进入内皮细胞，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，有利于血管的形成。(3)本专利技术的靶向穿膜肽基因载体同时具有穿膜肽和核定位信号的功能，有利于携带基因高效地进入细胞和细胞核，从而大大提高基因递送效果，达到基因治疗的目的。(4)本专利技术采用穿膜肽TAT作为负载基因部分，降低了基因载体毒性，提高了其生物相容性及其细胞摄取率。并且，将REDV多肽和核定位序列NLS整合到TAT序列中，赋予了基因载体内皮细胞选择性和核定位的功能另外，为了让这三种多肽序列能更好的发挥各自的功能，向三种多肽序列之间引入柔性的甘氨酸，从而提高基因递送效果，促进缺陷血管组织处血管生成。附图说明图1为靶向穿膜肽基因载体及其基因复合物的细胞相对活性图。图2(1)为6小时的细胞迁移图。图2(2)为由Image-ProPlus6.0计算的细胞迁移数量。图3(1)为体外血管形成图。图3(2)为由Image-ProPlus6.0计算的血管状结构数量。为体外血管形成图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。应理解，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外，在阅读本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术做改动或修改,该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。EA.hy926细胞购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。本专利技术的靶向穿膜肽基因载体：REDV-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV和REDV-Gm-YGRKKRRQRRR-Gn-PKKKRKV：其中的序列REDV源于天然纤维连接蛋白的一段多肽序列，具有对内皮细胞特异性选择粘附的功能。序列YGRKKRRQRRR(TAT)源于人免疫缺陷病毒(HIV-1)的一段多肽序列，具有跨膜转移到细胞质和细胞核内的功能。序列PKKKRKV(NLS)源于猿猴病毒40(SV40)的大T抗原中。实施例1一种靶向穿膜肽基因载体，所述载体的氨基酸序列为REDV-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV(REDV-TAT-NLS)(SEQIDNO.1所示)。实施例2一种靶向穿膜肽基因载体，所述载体的氨基酸序列为REDV-G-YGRKKRRQRRR-G-PKKKRKV(REDV-G-TAT-G-NLS)(SEQIDNO.2所示)。实施例3一种靶向穿膜肽基因载体，所述载体的氨基酸序列为REDV-G4-YGRKKRRQRRR-G4-PKKKRKV(REDV-G4-TAT-G4-NLS)(SEQIDNO.3所示)。实施例4靶向穿膜肽基因载体(以下简称基因载体)与ZNF580基因(本专利技术以ZNF580基因为例，但此基因并不对本专利技术有任何限定)制备N/P摩尔比为30的基因复合物，包括如下步骤：将浓度为0.10毫克/毫升的ZNF580基因(SEQIDNO.4所示)水溶液在搅拌条件下，按N/P(基因载体中的氮/ZNF580基因中的磷摩尔比)＝30的比例滴加到基因载体水溶液中，搅拌1小时,得到基因复合物。对照穿膜肽基因载体(以下称对照基因载体)，其序列为YGRKKRRQRRR-PKKKRKV(TAT-NLS)与ZNF580基因制备N/P摩尔比为30的对照基因复合物，包括如下步骤：将浓度为0.10毫克/毫升的ZNF580基因(SEQIDNO.4所示)水溶液在搅拌条件下，按N/P(对照基因载体中的氮/ZNF580基因中的磷摩尔比)＝30的比例滴加到对照基因载体水溶液中，搅拌1小时,得到对照基因复合物。基因载体和基因复合物的细胞毒性由MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，包括如下步骤：EA.hy926细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)DMEM细胞培养基中，细胞生长到90％后，将DMEM细胞培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后培养基换为新鲜的10％FBSDMEM生长培养基。将基因载体水溶液加入到10％FBSDMEM生长培养基中，使基因载体的浓度分别为5、10、15、20、30、40、60、80、100、120微克/毫升；再将基因复合物水溶液加入到10％FBSDMEM生长培养基中，使基因复合物的浓度分别为5、10、15、20、30、40、60、80、100、120微克/毫升；混合均匀，24小时后弃去上层清液，向每个孔中加入5毫克/毫升的MTT溶液(PBS缓冲溶液为溶剂)20微升，继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向穿膜肽基因载体，其特征是所述载体的氨基酸序列为：REDV‑YGRKKRRQRRR‑PKKKRKV。

【技术特征摘要】
1.一种靶向穿膜肽基因载体，其特征是所述载体的氨基酸序列为：REDV-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV。2.权利要求1的靶向穿膜肽基因载体递送基因的应用。3.一种靶向穿膜肽基因载体，其特征是所述载体的氨基酸序列为：R...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯亚凯，郝雪芳，郭锦棠，任相魁，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12