一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法技术

一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，该方法包括：测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；在PDA培养基培养羊肚菌菌丝，利用复合酶液降解羊肚菌菌丝细胞的细胞壁，收集羊肚菌的原生质体制成菌丝液；将构建完成的外源质粒与羊肚菌菌丝液置于电极杯中，在外加电场的作用下完成电击过程，电击后的羊肚菌菌丝体涂布于再生培养基中，在含有潮霉素的培养基上进行抗性筛选，分子检测正常生长的转化子是否为阳性转化子。本发明专利技术针对羊肚菌的结构特征和生长特性而建立的适用于羊肚菌的遗传转化体系，为羊肚菌的基因功能研究提供基础的技术保障，同时为开发羊肚菌的食药用价值提供重要的分子基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法
本专利技术属于羊肚菌生物工程领域，具体涉及一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法。
技术介绍
羊肚菌(Morchella)是子囊菌纲(Ascomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌属(Morchella)的珍稀的食、药两用的真菌，又称草笠竹、羊肚菜、羊蘑、羊肚蘑。目前中国已知的羊肚菌种类已经有很多，比较常见的有羊肚菌、小顶羊肚菌、尖顶羊肚菌、粗柄羊肚菌、小羊肚菌等。羊肚菌是著名的珍稀食用菌，其营养丰富，食药用价值极高，据《食疗本草》记载：其甘寒无毒，化痰理气，益肠胃。现在医学研究表明，具有提高免疫能力、抗疲劳、降血脂、抗肿瘤等功效。近年来，羊肚菌的人工栽培，生理生化特点以及生活史的研究都具有突飞猛进的发展，研究发现羊肚菌多糖是羊肚菌食药用价值的重要体现者。虽然关于羊肚菌生理功能研究较多，但是分子水平的研究少之又少，其中主要的原因就是缺乏成熟的遗传转化方法，导致基因的功能分析受到阻碍。建立成熟稳定的遗传转化方法是解析羊肚菌药用价值的关键技术，目前食用菌的遗传转化方法很多，如PEG法、基因枪法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其包括如下步骤：1)测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；2)制备菌丝液将羊肚菌菌种接种于液体PDA培养基中，23～28℃静置培养3～5天，得到羊肚菌菌丝；将羊肚菌菌丝过滤，复合酶解液酶解，酶解时间为1.5～3.5h；酶解后离心，再加入电击缓冲液制成羊肚菌菌丝液；其中，所述复合酶解液包含溶壁酶0.005～0.02g/mL、蜗牛酶0.001～0.01g/mL、纤维素酶0.005～0.02g/mL；3)电击转化向电极杯中加入电击缓冲液和步骤2)制得的羊肚菌菌丝液，再加入外源质粒吹打混匀，放入冰中静置；用高压脉冲电击转化仪电击，电压为1000～2000V，冰上...

【技术特征摘要】
1.一种利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其包括如下步骤：1)测定羊肚菌菌丝对潮霉素的最低耐受浓度；2)制备菌丝液将羊肚菌菌种接种于液体PDA培养基中，23～28℃静置培养3～5天，得到羊肚菌菌丝；将羊肚菌菌丝过滤，复合酶解液酶解，酶解时间为1.5～3.5h；酶解后离心，再加入电击缓冲液制成羊肚菌菌丝液；其中，所述复合酶解液包含溶壁酶0.005～0.02g/mL、蜗牛酶0.001～0.01g/mL、纤维素酶0.005～0.02g/mL；3)电击转化向电极杯中加入电击缓冲液和步骤2)制得的羊肚菌菌丝液，再加入外源质粒吹打混匀，放入冰中静置；用高压脉冲电击转化仪电击，电压为1000～2000V，冰上静置10～20min；再加入液体再生PDA培养基，摇床培养1～2d；4)筛选取经过步骤3)转化处理后的菌丝液涂布于无潮霉素的再生PDA平板上，23～28℃培养，切取新生长的菌丝，转入含有最低耐受浓度的潮霉素的再生PDA平板上，筛选出能正常生长的菌丝体，即转化子；提取转化子基因组DNA，进行PCR分子检测，成功扩增出外源基因则为阳性转化子。2.根据权利要求1所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤1)、步骤4)中，所述的最低耐受浓度为5-7μg/mL。3.根据权利要求1或2所述的利用电击法进行羊肚菌遗传转化的方法，其特征在于，步骤1)、步骤4)中，所述的最低耐受...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕贝贝，唐雪明，吴潇，蒋玮，王荣谈，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，上海瑞丰农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31