一种验证急性病毒性肝炎的动物模型及其构建方法技术

本发明专利技术属于医学领域，公开了一种验证急性病毒性肝炎动物模型及其构建方法，包括：清洁级雄性大鼠240只，体重240g～350g；动物随机分为正常对照组、急性病毒性肝炎模型组；细胞培养；接种造模；RNA微阵列基因检测；表达实验和分析；构建一种验证急性病毒性肝炎的动物模型。本发明专利技术构建方法具有操作简单，成本低的特点，耐药肝癌HepG2细胞模型稳定性高、自噬活性高，有助于在体外分析；本发明专利技术可用于肝癌细胞耐药性的早期诊断试剂盒；可用于筛选改善肝癌自噬活性的药物以有效改善肝癌细胞的耐药状态。实验证明，通过本发明专利技术建立的耐药肝癌HepG2细胞模型具有稳定96小时以上的胰岛素抵抗性。

An animal model for the verification of acute viral hepatitis and its construction

The invention belongs to the field of medicine, and discloses a verification of acute viral hepatitis animal model and its construction methods, including: male 240 rats, weighing 240g ~ 350g; animal were randomly divided into normal control group, model group of acute viral hepatitis; cell culture; inoculation model; detection of RNA gene microarray experiments; expression and analysis; animal model is a validation of acute viral hepatitis. The construction method has the advantages of simple operation, low cost, high stability of resistance model of hepatocellular carcinoma HepG2 cells, autophagy activity, contribute to the in vitro analysis; the invention can be used for early diagnosis of liver cancer cell resistance kit can be used for drug screening; improve the liver activity of autophagy in order to effectively improve the resistance of hepatocellular carcinoma cells. The experimental results showed that the HepG2 cell model established by the present invention has stable insulin resistance for more than 96 hours.

【技术实现步骤摘要】
一种验证急性病毒性肝炎的动物模型及其构建方法
本专利技术属于医学领域，尤其涉及一种验证急性病毒性肝炎的动物模型及其构建方法。
技术介绍
胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)就是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，即靶组织对胰岛素反应的敏感性下降，由此，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。IR是II糖尿病(T2DM)发病的重要机制之一，改善IR是T2DM的基础研究及药物开发的重点。肝脏是胰岛素作用的靶组织之一，是胰岛素抵抗发生的主要部位。胰岛素敏感性降低可导致肝脏葡萄糖异生和葡萄糖输出增加与餐后高胰岛素血症，高胰岛素水平能进一步加重胰岛素抵抗程度，并促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，而胰岛素抵抗更是与包括肝癌等多种肿瘤的发生、进展、转移以及预后不良密切相关，还可促使肿瘤细胞对常规抗癌药物产生抗性，降低肿瘤治疗效果，产生肿瘤多药耐药(MDR)的作用。另外胰岛素抵抗的发生可以通过增加机体氧化应激水平而诱导自噬的发生。自噬是由内质网来源的双层膜结构包裹细胞质中的变性蛋白和受损细胞器形成自噬泡，并携带进入溶酶体内进行降解和加工的过程，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法包括以下步骤：清洁级雄性大鼠240只，体重240g～350g；动物随机分为正常对照组、急性病毒性肝炎模型组；细胞培养：将常规培养的肝癌HepG2细胞接种于含10％～15％DMEM培养基中在36℃～37℃，5％～10％CO2培养箱中孵育至少12h～18h，使之完全贴壁后备用；先用无血清培基洗涤备用的肝癌HepG2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h～12h，然后加入1μmol/L～1.5μmol/L胰岛素，置于36℃～37℃，5％～10％培养箱中孵育72h～96h，从培养箱中取出弃培养上清液，...

【技术特征摘要】
2017.06.08 CN 20171045175231.一种验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法包括以下步骤：清洁级雄性大鼠240只，体重240g～350g；动物随机分为正常对照组、急性病毒性肝炎模型组；细胞培养：将常规培养的肝癌HepG2细胞接种于含10％～15％DMEM培养基中在36℃～37℃，5％～10％CO2培养箱中孵育至少12h～18h，使之完全贴壁后备用；先用无血清培基洗涤备用的肝癌HepG2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h～12h，然后加入1μmol/L～1.5μmol/L胰岛素，置于36℃～37℃，5％～10％培养箱中孵育72h～96h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L～0.05mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次～4次，然后再用pH6.0～6.5的酸性DMEM培养液36℃～37℃孵育15min～25min；再用0.01mol/L～0.05mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤4～6次，即成肝癌HepG2细胞的培养；所述DMEM培养基中溶质由按照质量体积比计的如下组分组成：丙氨酸5-35mg/L、精氨酸10-60mg/L、天门冬酰胺5-25mg/L、天冬氨酸15-80mg/L、胱氨酸5-30mg/L、谷氨酸50-100mg/L、谷氨酰胺40-80mg/L、甘氨酸5-20mg/L、组氨酸5-10mg/L、异亮氨酸5-15mg/L、亮氨酸10-20mg/L、赖氨酸10-25mg/L、甲硫氨酸10-30mg/L、苯丙氨酸5-20mg/L、脯氨酸10-40mg/L、丝氨酸10-30mg/L、苏氨酸10-40mg/L、色氨酸5-80mg/L、酪氨酸10-50mg/L、缬氨酸10-20mg/L、羟基脯氨酸5-10mg/L、高半胱氨酸2-10mg/L、牛磺酸5-15mg/L；接种造模：用培养好的肝癌HepG2细胞接种于急性病毒性肝炎模型组；将肝癌HepG2细胞液0.05ml～0.1ml连续接种15天；观察大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现；RNA微阵列基因检测：30天后，将接种急性病毒性肝炎模型组的大鼠处死，肺脏被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用MirVanamicroRNAisolationkit按照说明书收集总RNA；取适量RNA溶液，经紫外分光光度计定量测定RNA样品OD260和OD280值，计算RNA浓度，1％琼脂糖电泳观察总RNA，取2-5μg用Microconcentrifugalfilter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个核苷酸的小RNA；应用Poly聚合酶将小RNA的3’端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μParafloTMmicroRNA微阵列基因；表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μParafloTM微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺SSPE缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，Array--Pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microRNA，包含数据库中成熟的microRNA和部分成熟microRNA的互补链；芯片上的检测探针均进行18个重复，实验进行4次。2.如权利要求1所述的验证急性病毒性肝炎动物模型的构建方法，其特征在于，表达实验和分析后还需进行：实时荧光定量PCR检测：用MirVanamicroRNAisolationkit按照说明书收集总RNA，计算RNA浓度；特异逆转录引物从TaqmanMicroRNAAssays获得，并用TaqmanMicroRNAReverseTranscriptionKit将RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测，反应结束后用ABIPrism7900软件分析结果，PCR实验进行6次，用比...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙西寨，张贵生，邓振旭，孙李龙，
申请(专利权)人：菏泽学院，
类型：发明
国别省市：山东,37