使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递制造技术

本发明专利技术涉及使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递。具体地，涉及用于将感兴趣的线性核酸分子导入包含细胞壁的细胞中的方法包括使用用聚乙二醇包被的纳米颗粒。在一些实施方案中，包含细胞壁的细胞是植物细胞。方法包括遗传或以其它方式修饰植物，并用于治疗或预防包含细胞壁的植物细胞中的疾病。转基因植物包含通过自用线性核酸分子转化的植物细胞再生全植物生成的感兴趣的核酸分子。

Linear DNA molecular delivery using stable PEG quantum dots for stable transformation in plants

The present invention relates to linear DNA molecular delivery using PEG quantum dots for stable transformation in plants. Specifically, methods involving the introduction of linear nucleic acid molecules of interest into cells containing cells wall include the use of nanoparticles coated with polyethylene glycol. In some embodiments, cells that contain cell walls are plant cells. Methods include genetically modified or otherwise modified plants and used in the treatment or prevention of diseases in plant cells including cell walls. Transgenic plants contain plant nucleic acid molecules transformed by their own linear nucleic acid molecules to regenerate the interesting nucleic acid molecules generated by the whole plant.

【技术实现步骤摘要】
使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递本申请是2011年7月7日提交的申请号为201180038860.9(国际申请号PCT/US2011/043221)、专利技术名称为“使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递”的专利技术专利申请的分案申请。优先权要求本申请要求2010年7月7日提交的美国临时专利申请流水号61/362,224关于“LINEARDNAMOLECULEDELIVERYUSINGPEGYLATEDQUANTUMDOTSFORSTABLETRANSFORMATIONINPLANTS”的提交日权益。
本专利技术涉及使用纳米颗粒以将线性核酸分子非侵入投递入具有细胞壁的植物细胞中的方法。专利技术背景纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至特定动物细胞。已经发现了，在将某些经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的基因。也已经使用在大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如，量子点(“QD”))作为载体来将分子投递入细胞中。DNA和蛋白质可以与附着于QD表面的某些配体连接。见例如Patolsky,等(2003)J.Am.Chem.Soc.125:13918。可以通过使用标准的生物缀合方案将经羧酸或胺包被的QD与含有硫醇基团(见例如Dubertret等(2002)Science298:1759；Akerman,等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12617；Mitchell,等(1999)J.Am.Chem.Soc.121:8122)，或N-羟基琥珀酰亚氨基(“NHS”)酯基的分子交联。见例如Pinaud等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Bruchez等(1998)Science281:2013。一种将分子附着于QD表面的备选方式是经由将经链霉抗生物素蛋白包被的QD与生物素化的蛋白质、寡核苷酸、或抗体缀合进行。见例如Dahan,等(2003)Science302:442；Pinaud,等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Wu,等(2003)NatureBiotechnol.21:41；Jaiswal,等(2003)NatureBiotechnol.21:47；及Mansson,等(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.314:529。由于存在植物细胞壁，将外来核酸分子投递至植物是挑战性的。目前的方法依赖于侵入性投递以遗传转化植物。在植物细胞中，细胞壁是针对投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性细胞投递方法，例如生物射弹(基因枪)、微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来实现基因和小分子对有壁的植物细胞中的投递，但是蛋白质的投递仅已经通过微注射实现。在用纳米颗粒将核酸分子投递至植物细胞是期望的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前除去细胞壁。见例如Torney,等(2007)NatureNanotechnol.2:295-300。专利技术概述本文中描述了使用纳米颗粒和线性化的核酸分子以将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法和组合物。可以使用公开内容的方法的一些实施方案来生成经稳定转化的经遗传修饰的能育植物。在一些实施方案中，线性核酸分子的独特特性容许投递没有外来核酸序列的感兴趣的特定基因序列，所述外来核酸序列对转基因靶生物体可以具有调节后果。在一些实施方案中，纳米颗粒可以用线性核酸分子进行PEG化。在具体的实施方案中，纳米颗粒可以是半导体纳米颗粒，诸如量子点(“QD”)。在一些实施方案中，线性核酸分子可以是线性化的质粒DNA。在其它实施方案中，线性核酸分子可以包含编码膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)和/或黄色荧光蛋白(YFP)的序列。还公开了用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法可以包括提供具有细胞壁的植物细胞；用PEG包被纳米颗粒的表面以生成“PEG化的”纳米颗粒；用至少一种感兴趣的线性核酸分子包被PEG化的纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和用感兴趣的线性核酸分子包被的PEG化的纳米颗粒置于彼此接触中；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入包含细胞壁的细胞中。进一步公开了用于将性状基因渗入(introgress)植物中的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括提供植物细胞；用PEG包被纳米颗粒的表面以生成PEG化的纳米颗粒；用供在所述植物中表达所述性状用的手段(means)包被PEG化的纳米颗粒；将植物细胞和用供在植物中表达性状用的手段包被的PEG化的纳米颗粒置于彼此接触中；容许所述纳米颗粒和供在植物中表达性状用的手段摄取入所述植物细胞中以生成经转化的植物细胞；自经转化的植物细胞再生全植物；并繁殖所述植物。在一些实施方案中，可以依照本专利技术的方法基因渗入的性状包括性状，其选自但不限于如下的：雄性不育；除草剂抗性；昆虫抗性；和对细菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。还公开了本专利技术的方法，其可以用于在植物内(inplanta)转化植物。在一些实施方案中，植物可以选自拟南芥属(Arabidopsis)的植物，例如拟南芥(A.thaliana)。在具体的实施方案中，通过植物内转化来转化的植物可以选自哥伦比亚(Columbia)生态型的拟南芥植物。另外，公开了经遗传修饰的(GM)植物细胞及其生成方法，其中所述植物细胞具有经由本专利技术的方法导入其中的一种或多种核酸。在一些实施方案中，可以经由依照本专利技术的纳米颗粒将质粒导入具有细胞壁的植物细胞中，所述质粒包含至少一种感兴趣的基因和选择标志。在其它实施方案中，可以选择稳定的转化体，其已经稳定整合至少一种感兴趣的基因和/或选择标志。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含至少一种感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。进一步公开了创建在组织培养中使用的包含感兴趣的分子的可再生植物细胞的方法。组织培养物可以能够再生与可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以例如是胚；原生质体；分生细胞；愈伤组织；花粉；叶；花药；根；根尖；花；种子；荚果；或茎。更进一步，一些实施方案提供了自本专利技术的组织培养物再生的植物。进一步公开了用于生成包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的稳定化植物系的方法，其中首先可以通过纳米颗粒摄取穿过植物细胞壁来导入所述期望的性状或感兴趣的核酸分子。生成稳定化的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下的技术，诸如但不限于自交；回交；杂种生成；与群体杂交；等等。如此，还公开了包含首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物和植物细胞。可以在与另一不同植物细胞的杂交中使用包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物细胞以生成具有期望特征的第一代(F1)杂种细胞；种子；和/或植物，所述期望的性状或感兴趣的核酸分子首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物或细胞(或其祖先)中。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将感兴趣的线性核酸分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：提供具有细胞壁的植物细胞；用聚乙二醇包被半导体纳米颗粒；用感兴趣的线性核酸分子包被所述半导体纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的半导体纳米颗粒置于彼此接触；并容许所述半导体纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入所述包含细胞壁的细胞中，所述摄取通过容许所述半导体纳米颗粒和感兴趣的线性核酸分子移位穿过细胞壁并进入植物细胞而进行，其中所述移位不由于生物射弹、基因枪、微注射、和/或刺穿感染技术而发生。

【技术特征摘要】
2010.07.07 US 61/362,2241.一种将感兴趣的线性核酸分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：提供具有细胞壁的植物细胞；用聚乙二醇包被半导体纳米颗粒；用感兴趣的线性核酸分子包被所述半导体纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的半导体纳米颗粒置于彼此接触；并容许所述半导体纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入所述包含细胞壁的细胞中，所述摄取通过容许所述半导体纳米颗粒和感兴趣的线性核酸分子移位穿过细胞壁并进入植物细胞而进行，其中所述移位不由于生物射弹、基因枪、微注射、和/或刺穿感染技术而发生。2.依照权利要求1的方法，进一步包括容许所述半导体纳米颗粒摄取入所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。3.依照权利要求2的方法，进一步包括用亚细胞区室靶向蛋白包被所述半导体纳米颗粒。4.依照权利要求3的方法，其中所述区室选自下组：胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。5.依照权利要求1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是来自商业作物物种的植物细胞。6.依照权利要求5的方法，其中所述植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryzasp.)、拟南芥属物种(Arabidopsissp.)、蓖麻属物种(Ricinussp.)、和甘蔗细胞。7.依照权利要求5的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。8.依照权利要求1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是培养的细胞。9.依照权利要求1的方法，其中所述半导体纳米颗粒是量子点。10.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣的线性核酸分子包含选自下组的核酸序列：DNA、RNA、RNAi分子、和基因。11.依照权利要求10的方法，其中所述感兴趣的线性核酸分子包含基因。12.依照权利要求11的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农艺学基因、或标志物基因。13.依照权利要求1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·C·桑伯朱，K·Y·姚，F·G·伯勒斯，J·P·塞缪尔，S·R·韦布，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US