IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种IDH1/2基因突变的检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液和SYBR GreenI混合液；PCR检测液A包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B和肽核酸B,PCR检测液C包括用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C和肽核酸C。本发明专利技术的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行IDH1/2基因突变检测。

IDH1/2 gene mutation detection system and its kit

The present invention relates to a IDH1/2 gene mutation detection system and kit kit, including PCR and SYBR GreenI detection liquid mixture; PCR A includes detection liquid for the detection of IDH1/2 gene codon 394th C394T loci and 395th codon G395A loci primers A and peptide nucleic acid A, PCR B for liquid detection detection of IDH1/2 gene codon 419th G419A loci primers B and peptide nucleic acid B, including C PCR test liquid for the detection of IDH1/2 gene codon 515th G515A loci primers C and C peptide nucleic acid. The IDH1/2 gene mutation detection system and its kit has high sensitivity and specificity, and less sample demand. It can detect IDH1/2 gene mutation quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测IDH1/2基因突变的方法和检测产品，属于生物

技术介绍
2008年，Parsons等对20661个蛋白质编码基因进行高通量表达分析研究，首次发现在胶质母细胞瘤中约有12％发生了异柠檬酸脱氢酶1(isocitratedehydrogenase1，IDH1)的基因突变，随后，更多学者进一步的研究发现IDH1/2突变作为预后良好标志普遍存在于Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤以及继发性胶质母细胞瘤，并在肿瘤的发生、发展以及演变过程发挥着重要作用。IDH1/2基因突变是最常见的代谢酶基因突变类型，在胶质瘤和急性髓细胞白血病的一些亚型中相当普遍。软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等实体瘤也有报道。IDH突变状态与肿瘤病理分型密切相关，并且IDH突变是胶质瘤发生进展的早期事件，因此，IDH突变检测不仅能在诊断上更为及时全面，而且对于进一步深入研究肿瘤发病机制和生物学特征具有重要意义。IDH1/2基因突变检测有助于针对该突变位点及癌代谢物的靶向治疗药物的开发，使得靶向治疗更具有效性、特异性，并减少不良反应。因此IDH1/2基因突变检测方法的建立对肿瘤的预防和治疗具有重要的指导意义。目前对肿瘤相关基因的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。目前进行IDH1/2基因突变检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测IDH1/2基因突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的IDH1/2基因突变检测是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行IDH1/2基因突变检测的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测体系，包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A，用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B，用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C，荧光染料SYBRGreenI，以及肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的肽核酸C。上述上下游引物进行了LNA修饰。上述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。上述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.15μM/L。上述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述肽核酸A、B、C在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的IDH1/2基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B、PCR检测液C和SYBRGreenI混合液；所述PCR检测液A包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B和肽核酸B，PCR检测液C包括用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C和肽核酸C；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的肽核酸C。上述上下游引物进行了LNA修饰；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述IDH1/2基因突变检测试剂盒还包括阳性对照P1、阳性对照P2和阴性对照；所述阳性对照液P1是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的野生型质粒溶液；所述阳性对照液P2是浓度为100ng/μL的包含IDH1/2基因C394T、G395A、G419A、G515A位点的突变型质粒溶液；所述阴性对照液是不含IDH1/2基因的基因组DNA溶液。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需通过熔解曲线分析，即可将IDH1/2基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。(2)本专利技术的IDH1/2基因突变检测方法及其试剂盒，可同时检测第394/395、419、515密码子任意一种突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本专利技术容易地检测出非常低浓度样本的IDH1/2位点的基因型，克服了TaqMan探针法需要使用多条特异性探针分别进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。(3)本专利技术选择SYBRGreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。附图说明图1采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的C394T和G395A位点野生型特异性产物峰Tm值。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的G419A位点野生型特异性产物峰Tm值。图3采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的G515A位点野生型特异性产物峰Tm值。图4是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A，用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B，用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C，荧光染料SYBR Green

【技术特征摘要】
2017.11.09 CN 20171109470201.一种IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测IDH1/2基因第394密码子C394T位点和第395密码子G395A位点的上下游引物A，用于检测IDH1/2基因第419密码子G419A位点的上下游引物B，用于检测IDH1/2基因第515密码子G515A位点的上下游引物C，荧光染料SYBRGreen，以及肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第394密码子C394T位点和野生型第395密码子G395A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的肽核酸A，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第419密码子G419A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的肽核酸B，核苷酸序列与IDH1/2野生型基因第515密码子G515A位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的肽核酸C。2.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。4.根据权利要求3所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.15μM/L。5.根据权利要求1所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。6.根据权利要求5所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B、C在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。7.一种采用如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31