一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用。本发明专利技术筛选得到了一株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白的杂交瘤细胞株，该细胞株所分泌的单克隆抗体CSFV‑1C8与CSFV的E2蛋白能够发生特异性反应，而与牛病毒性腹泻/粘膜病病毒E2蛋白不发生反应；该单克隆抗体能特异的识别猪瘟病毒E2蛋白，且其识别的表位为：FDFDGPDGL；本发明专利技术的单克隆抗体及该单克隆抗体所识别的猪瘟病毒E2蛋白表位可制成检测CSFV的试剂，为建立猪瘟病毒抗体的血清学检测方法奠定了基础。本发明专利技术建立的一种检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒具有特异、敏感和操作简便等优点，适合猪瘟抗体的大规模筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用
本专利技术涉及猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其在应用，属于兽用生物制品领域，。
技术介绍
猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)的重要成员猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定的必需报告的疫病之一，在我国属一类动物传染病。CSFV为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径为25-50nm。与CSFV同属的还有牛病毒性腹泻病病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)和羊边界病病毒(Borderdiseasevirus,BDV),这三种病毒结构相似，血清学上存在交叉反应，并且有相似的宿主范围。猪(包括家猪和野猪)是唯一的易感宿主。CSF根据病程的不同可分为急性、亚急性、慢性和非典型性猪瘟。近些年来，世界范围内CSF流行发生了明显变化：从以前的大规模暴发流行转变为地区性、周期性、散发形式。一些原本宣布消灭CSF的国家又相继出现复发，我国的CSF发病率也呈上升趋势。同时，多种病原混合感染也成为目前十分严重的现象，给临床诊断和防治工作带来了很大的困难。CSFV的囊膜糖蛋白E2(gp55)是研究得较为清楚的一种结构蛋白。其位于病毒囊膜表面。在CSFV编码的蛋白中，E2是最不保守的一种蛋白，但又是CSFV的主要保护性抗原蛋白，主要参与病毒的感染过程并诱导机体产生中和抗体。其空间构型由三个疏水区和三个N端的链内二硫键构成。E2蛋白由ORF编码的690(Arg)至1060(Leu)之间的370个氨基酸残基组成，在靠近E2蛋白N端上游有一段信号肽序列。利用针对E2蛋白的各种单抗，Wensvoort通过实验已证实CSFVE2具有4个相对独立的抗原结构域，分别为A、B、C和D，其中A、B、C含有中和性抗原表位。后经vanRijn等人的研究，将这4个区域的位置确定下来。按照vanRijn等预测的E2抗原结构模型，这些抗原结构域位于E2蛋白近N端的1/2部分，且处于两个相对独立的抗原结构单位，一个由结构域B和C组成，另一个则由高度保守的A构成，A又可分为A1、A2、A3三个亚结构域，A结构域中含有一疏水区，此疏水区在瘟病毒属中高度保守。A1和A2都很保守，只有A1能产生中和性抗体；A3与D既不产生中和性抗体，也不保守。CSFV上述抗原结构单位(B/C或A)所诱导的免疫反应都足以保护猪免受强毒攻击，由于E2蛋白是CSFV的免疫优势蛋白，所以人们一直尝试着把E2囊膜糖蛋白作为研制针对CSFV新型疫苗的首选靶蛋白。2000年Lin等报道了CSFVE2抗原表位TAVSPTTLR，该表位位于E2氨基酸序列的829～837位，具有中和活性，在CSFV内高度保守，为CSFV特异的抗原表位，而其他瘟病毒没有这一表位；此外，E2还具有一个所有瘟病毒都有的保守性抗原表位YYEP，位于E2羧基端得995～998位氨基酸。通过对E2蛋白单克隆抗体的进一步筛选，继而进一步获得E2蛋白抗原表位信息，不仅有助于分析E2蛋白的结构，对CSFV的新型诊断技术研发和猪瘟病毒的基础研究也具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株分泌猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之二是提供一株由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与CSFV-E2蛋白发生特异性反应；本专利技术的目的之三在于提供含有该株单克隆抗体的抗体检测试剂盒；为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.13387。2.本专利技术所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株能稳定地分泌猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。3.本专利技术所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该CGMCCNo.13387细胞株分泌的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体在检测猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。4.本专利技术所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该试剂盒主要含有包被了猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板和由抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞CGMCCNo.13387株产生的被标记辣根过氧化物酶的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。5.本专利技术所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该试剂盒为猪瘟病毒E2检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒。具体实施方式1.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株的制备(1)动物免疫取6周龄的BALB/C雌性小鼠5只，将真核表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，按100μg/只的剂量在小鼠背部多点注射；14天后，采用E2蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合乳化后，按上述方法进行加强免疫；14天后，重复免疫1次。14天后，眼眶采血，分离血清，用间接ELISA方法测定免疫小鼠抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠，腹腔注射100μgE2蛋白。3天后，取脾脏进行细胞融合。(2)细胞融合细胞融合前1天。制备饲养细胞。按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞，铺于96孔细胞培养板中。融合当天，断颈处死免疫小鼠，无菌摘取脾脏，分别用150目和200目的铜网进行研磨和过滤，与处于对数生长期的SP2/0细胞按照10:1的比例进行混合，离心弃上清，在1min内向细胞混合物中缓慢加入1ml50％PEG，随后分步加入10mlDMEM培养基进行终止。离心后，用含1％HAT和15％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，铺于96孔细胞培养板中。(3)杂交瘤细胞的筛选和亚克隆将猪瘟病毒Thiveral株病毒用无血清培养基稀释至200TCID50/0.1ml，接种长满单层的96孔PK15细胞板中，37℃5％CO2培养72h后，弃培养液，固定，用于融合细胞的筛选。将融合细胞上清加入到固定后的PK15细胞板中，37℃反应1h，PBS漂洗3次，加入工作浓度的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1h。PBS漂洗3次后，置于倒置荧光显微镜下观察。将出现特异性胞浆染色的阳性孔中对应的杂交瘤细胞，用有限稀释法进行亚克隆，重复上述筛选方法，亚克隆3～4轮，最终获得一株稳定分泌CSFVE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.13387，将其分泌的抗体命名为猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体1C8，本专利技术又简称1C8抗体。(4)单克隆抗体腹水的制备取经产的BALB/C小鼠，腹腔注射无菌的液体石蜡，0.5ml/只，1周后，腹腔注射杂交瘤细胞CSFV-1C8，1～2×105个/ml，0.5ml/只，待小鼠腹腔膨大，出现明显波动感时，用注射器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV‑1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13387。

【技术特征摘要】
1.一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.13387。2.如权利要求1所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株能稳定地分泌猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。3.如权利要求1所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该CG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琴，徐璐，张乾义，赵启祖，范学政，邹兴启，朱元源，李翠，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11