CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及抗癌药物领域，具体公开了一种CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用，所述的CTCF陷阱蛋白是一种人工表达的重组蛋白，它去除了野生型CTCF的N端和C端功能区，保留其辛指结构ZF并添加DNA甲基化酶Sss1。本发明专利技术在研究中发现，在UM细胞中转入陷阱CTCF可显著抑制葡萄膜黑色素瘤的生长和转移。本发明专利技术提供的CTCF陷阱蛋白为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后。

Application of CTCF trap protein in preparation of anti uveal melanoma medicine

The present invention relates to the field of anti-cancer drugs, application of a CTCF trap protein in preparing anti uveal melanoma drug in the specific public, CTCF trap the recombinant protein protein is a kind of artificial expression, it removes the wild type CTCF N and C terminal function area, retaining its symplectic structure ZF and add DNA methyltransferase Sss1. In the present study, it is found that the transfer of trap CTCF into UM cells can significantly inhibit the growth and metastasis of uveal melanoma. The CTCF trap protein provided by the invention provides a new target and a therapeutic drug for the clinical treatment of uveal melanoma, improves the therapeutic effectiveness, reduces the enucleation rate of the eyeball, and improves the visual prognosis of the patient.

【技术实现步骤摘要】
CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用
本专利技术属于抗肿瘤药物领域，具体涉及一种CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。
技术介绍
葡萄膜黑色素瘤(Uvealmelanoma,UM)是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，是黑色素瘤的一种特殊类型，起源于眼葡萄膜层，其中大多数为脉络膜黑色素瘤。UM发生通常为单眼、单灶性，双眼发生或同一眼内发生多灶性肿瘤的病例十分罕见。UM恶性程度较高，不仅可以导致患者视力丧失，且易经血液发生远处转移，主要转移至肝脏，严重威胁患者生命。由于缺乏有效的早期诊断及治疗手段，UM患者常在确诊后一年内丧命。即使在无明确远处转移发生时摘除患眼眼球，其5年死亡率仍高达17％～53％。近年来黑色素瘤的发病率呈增长趋势，年增长率约为3～5％，已经成为临床上发病率增长最快的恶性肿瘤之一。CTCF是经典的构象相关蛋白之一，被证实参与染色体构象，基因印记以及DNA甲基化等多种表观遗传学调控，具有广泛的基因调控功能。CTCF蛋白主要包括N端，C端以及辛指结构(ZF)三个结构域，其中N端和C端为其蛋白功能区，辛指结构DNA结合区。通过人工合成CTCF重组蛋白，去除了其功能区N端和C端，保留近保留辛指结构，并添加DNA甲基化酶Sss1保留其DNA甲基化功能。重组CTCF蛋白能在细胞内与野生型CTCF发生竞争性结合，但其仅存在结合能力，缺乏野生型CTCF的生物功能，故称为CTCF陷阱蛋白。CTCF陷阱蛋白被证实能通过改变细胞染色体构象调节基因表达，但其在葡萄膜黑色素瘤中应用尚未见报道，其对葡萄膜黑色素瘤的疗效和作用机制尚不清楚。专利技术内容本专利技术为了解决上述技术问题提供CTCF陷阱蛋白，旨在为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后。本专利技术的一种CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。优选的，所述的CTCF陷阱蛋白是一种人工表达的重组蛋白，它去除了野生型CTCF的N端和C端功能区，保留其辛指结构ZF并添加DNA甲基化酶Sss1。优选的，所述的CTCF陷阱蛋白的氨基酸序列为MVPKKKRKVEDKVGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCELCSYTCPRRSNLDRHMKSHTDERPHKCHLCGRAFRTVTLLRNHLNTHTGTRPHKCPDCDMAFVTSGELVRHRRYKHTHEKPFKCSMCDYASVEVSKLKRHIRSHTGERPFQCSLCSYASRDTYKLKRHMRTHSGEKPYECYICHARFTQSGTMKMHILQKHTENVAKFHCPHCDTVIARKSDLGVHLRKQHSYIEQGKKCRYCDAVFHERYALIQHQKSHKNEKRFKCDQCDYACRQERHMIMHKRTHTGEKPYACSHCDKTFRQKQLLDMHFKRYHDPNFVPAAFVCSKCGKTFTRRNTMARHADNCAGPDGVEGENGFEGSGGGGSGGGGSGGGLGSTLEMSKVENKTKKLRVFEAFAGIGAQRKALEKVRKDEYEIVGLAEWYVPAIVMYQAIHNNFHTKLEYKSVSREEMIDYLENKTLSWNSKNPVSNGYWKRKKDDELKIIYNAIKLSEKEGNIFDIRDLYKRTLKNIDLLTYSFPCQDLSQQGIQKGMKRGSGTRSGLLWEIERALDSTEKNDLPKYLLMENVGALLHKKNEEELNQWKQKLESLGYQNSIEVLNAADFGSSQARRRVFMISTLNEFVELPKGDKKPKSIKKVLNKIVSEKDILNNLLKYNLTEFKKTKSNINKASLIGYSKFNSEGYVYDPEFTGPTLTASGANSRIKIKDGSNIRKMNSDETFLYIGFDSQDGKRVNEIEFLTENQKIFVCGNSISVEVLEAIIDKIGG。一种包含CTCF陷阱蛋白的慢病毒在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。优选的，所述包含CTCF陷阱蛋白的慢病毒的制备方法如下：293T细胞计数，取4-8*106个细胞转入10cm培养皿，加入无血清DMEM培养基至10ml。取转染试剂Lipo200030μl与无血清DMEM500μl混合，室温静置5min。另取500μl无血清DMEM，加入CTCF陷阱蛋白质粒3μg，包装质粒PM3μg，包装质粒PS6μg，混匀。将上述两管液体混合，室温静置20min。静置后将液体加入上述10cm皿中，混匀后37℃，5％CO2培养。5小时后换液，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM10ml，继续37℃，5％CO2培养。48小时收上清，加入含10％胎牛血清的DMEM10ml，继续37℃，5％CO2培养。72小时再次收上清。取两次收取的上清，4000rpm，4℃，离心20min。用5ml注射器将慢病毒用滤器过滤后加入透析管，3500rpm离心30min，分装后-80度保存。CTCF陷阱蛋白是一种人工表达的重组蛋白，它去除了野生型CTCF的N端和C端功能区，保留其辛指结构ZF并添加DNA甲基化酶Sss1，蛋白结构如图1所示。申请者实验发现，CTCF陷阱蛋白能显著抑制葡萄膜黑色素瘤的生长和转移。有益效果：本专利技术在研究中发现，在UM细胞中转入陷阱CTCF可显著抑制葡萄膜黑色素瘤的生长和转移。本专利技术提供的CTCF陷阱蛋白为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后。附图说明图1为野生型CTCT和CTCF陷阱蛋白差异模式图。图2为细胞增殖实验结果图。图3中A图为Transwell细胞迁移实验大体结果图；B图为溶解结晶紫后测得的Transwell细胞迁移实验定量图。图4中A图为裸鼠皮下成瘤瘤体生长曲线图；B图为处死裸鼠后，取出瘤体的重量统计图。具体实施方式下面进一步说明本专利技术的实施例。实施例1细胞增殖实验(CCK8)实验材料：CCK8购自日本同仁化学构建CTCF陷阱蛋白稳定表达UM和正常细胞系，将包含CTCF陷阱蛋白的慢病毒加入UM细胞和正常细胞中，37℃，5％CO2培养48小时，传代后用终浓度8ug/ml的嘌呤霉素筛选4周。RealtimePCR验证CTCF陷阱蛋白表达后，将稳转系细胞和肿瘤细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，100ul培液，37℃，5％CO2培养，分别于0h，24h，48h，72h加入10ulCCK8，继续37℃孵育4h，上机测吸光度值见图2。从图2中可以得出陷阱CTCF蛋白能显著抑制葡萄膜黑色素瘤的增殖，对正常细胞增值能力无影响。实施例2实验名称：Transwell细胞迁移实验实验材料：Transwell小室购于millipore(美国密理博)；六孔板购自ThermoFisher(美国赛默飞)；结晶紫购自生工公司(生工中国)。实验步骤：使用8μm的24孔板Transwell小室。24孔板每孔内加入10％FBS的DMEM培养液900μl，将小室悬挂于24孔内，每个小室内接种10000个细胞于200μl的2％FBS的DMEM培养液中。培养2～3天后，吸去孔内和小室内培养液，PBS小心洗一次。加入结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述的CTCF陷阱蛋白是一种人工表达的重组蛋白，它去除了野生型CTCF的N端和C端功能区，保留其辛指结构并添加DNA甲基化酶Sss1。3.根据权利要求1或2所述的CTCF陷阱蛋白在制备抗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述的CTCF陷阱蛋白的氨基酸序列为MVPKKKRKVEDKVGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCELCSYTCPRRSNLDRHMKSHTDERPHKCHLCGRAFRTVTLLRNHLNTHTGTRPHKCPDCDMAFVTSGELVRHRRYKHTHEKPFKCSMCDYASVEVSKLKRHIRSHTGERPFQCSLCSYASRDTYKLKRHMRTHSGEKPYECYICHARFTQSGTMKMHILQKHTENVAKFHCPHCDTVIARKSDLGVHLRKQHSYIEQGKKCRYCDAVFHERYALIQHQKSHKNEKRFKCDQCDYACRQERHMIMHKRTHTGEKPYACSHCDKTFRQKQLLDMHFKRYHDPNFVPAAFVCSKCGKTFTRRNTMARHADNCAGPDGVEGENGFEGSGGGGSGGGGSGGGLGSTLEMSKVENKTKKLRVFEAFAGIGAQRKALEKVRKDEYEIVGLAEWYVPAIVMYQAIHNNFHTKLEYKSVSREEMIDYLENKTLSWNSKNPVSNGYWKRKKDDELKIIYNAIKLSEKEGNIFDIRDLYKRTLKNIDLLTYSFPCQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张赫，范先群，文旭洋，王茜，李芳，葛盛芳，贾仁兵，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31