一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术描述了一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫试剂盒及其制备方法，属于分析测试领域。该试剂盒包括：由结合珠蛋白单克隆抗体包被的酶标板、结合珠蛋白抗原标准品、结合珠蛋白单克隆抗体、酶标记的羊抗鼠抗体、稀释液、洗涤液、显色液及终止液。通过双抗体夹心间接酶联免疫吸附分析方法测定牛奶中的结合珠蛋白含量。以此检测奶牛隐性乳房炎。本发明专利技术操作简便，具有特异性高、灵敏度好、重现性好的特点，为奶牛隐性乳房炎检测提供了新的测试工具。

【技术实现步骤摘要】
一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和用途
本专利技术描述了一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于检测奶牛的隐性乳房炎。属分析测试领域。
技术介绍
乳房炎(Mastitis)是奶牛最常见、最多发、导致经济损失最严重的疾病之一，并危害着人类健康，这是因为乳房炎奶牛的乳汁中往往含有大量病原微生物、毒素或治疗后残留的抗生素，食用后可引起发热、呕吐、腹泻及过敏等不良反应。随着我国奶牛业和乳品工业的发展及人类对公共卫生的重视，奶牛乳房炎的危害已引起人们的广泛关注和高度重视。乳房炎不仅使奶牛产奶量显著下降而造成严重经济损失，还可导致乳汁成分发生改变，使牛奶的营养价值和食用价值显著下降。奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。临床型乳房炎会导致牛奶分泌大幅度下降，严重时奶牛甚至完全不能泌乳。隐性乳房炎发病率高，作用时间更长，而且长期潜伏在牛群中不易诊断。奶牛日产奶量与隐性乳房炎发病程度呈显著负相关，因此隐性乳房炎实际上比病例数较少的临床型乳房炎造成的经济损失更大。美国国家乳房炎委员会(NationalMastitisCouncil,NMC)1996年的调查数据显示每年全世界约三分之一的奶牛感染乳房炎，其直接经济损失达20亿美元，而仅加拿大一个国家，奶牛乳房炎造成的直接经济损失就达到了7亿英镑。同时，乳房炎被列为淘汰奶牛的主要原因，美国淘汰奶牛的26.5%是因为患乳房炎，在芬兰、挪威、瑞典因奶牛乳3房健康问题分别淘汰了奶牛的35%、19%和22%。我国目前奶牛存栏数为600万～700万头，主要集中在黑龙江、内蒙古及河北等地区，调查表明，奶牛乳房炎在我国的发病率达70%～80%，每年造成的直接经济损失约为30亿元人民币。目前检测奶牛隐性乳房炎主要是依靠检测牛奶中的体细胞数来进行，即牛奶SCC。牛奶体细胞数是目前衡量奶牛乳房炎的常用标准。其原理是当奶牛的泌乳系统受到各种细菌的侵袭而发生感染和损伤时，由于机体的免疫机制，血液中承担排除感染和修复任务的白细胞就会穿越毛细血管壁和乳腺泡壁层，进入腺泡腔而进入乳汁中，引起乳汁中体细胞总数的升高。因此，可通过乳汁SCC的变化来判断是否是隐性乳房炎。但是牛奶体细胞数的变化受到很多因素的影响，如年龄、泌乳期、昼夜、挤奶过程、病原菌感染等。导致目前的体细胞检测不能完全诊断奶牛乳房炎。近年来的研究发现，感染、创伤、炎症等应激原作用于动物机体，造成机体稳态失衡，会引起一系列反应，如发热、负氮平衡、白细胞增多、促肾上腺皮质激素和糖皮质激素分泌增多、补体系统和凝集系统激活、血清微量元素浓度改变及一些血浆蛋白浓度的改变等。在应激刺激下所产生变化的蛋白即为急性期蛋白(AcutePhaseProtein,APP)，又叫急性期反应物或应激敏感蛋白质。在奶牛发生隐性乳房炎时，急性期蛋白APP浓度会发生急剧变化。因此急性期蛋白APP作为奶牛乳房炎的生物标记物，成为继乳汁体细胞数之后，另一种奶牛乳房炎的诊断标准。奶牛发生乳房炎后，在各种致炎因子作用下，肝脏迅速合成APP，其浓度在血清和乳汁中都会上升，其中最显著的是牛血清珠蛋白HP。通过分析牛奶中血清珠蛋白HP的含量直接反应奶牛乳房的炎症状态。血清珠蛋白HP是血清α-球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的血清及其他体液中，其分子量约为125kDa，由16到23kDa的α链和35到40kDa的β链组成。在奶牛血清中，HP常和白蛋白结合成聚合体，分子量达到1000～2000kDa。人类HP在遗传多态现象中表现为3个亚型，犬类HP与人类HP1-1亚型相似，牛HP则与人类HP2-2亚型相似。HP最重要的诊断意义在于反刍动物HP在健康状态的血清中几乎是不存在的，只有在发生APR时才会产生，所以HP是反刍动物的主要APP。健康奶牛的血清HP浓度低于20mg/L，而感染乳房炎2天内，即可升高到2g/L。目前对于牛奶中血清珠蛋白HP的检测还没有有效的方法。本专利技术描述了一种酶联免疫吸附试剂盒，用于测定牛奶中血清珠蛋白的浓度，进而为奶牛隐性乳房炎诊断提供依据。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法，用于测定牛奶中血清珠蛋白的浓度，进而为奶牛隐性乳房炎诊断提供依据为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种酶联免疫吸附试剂盒，该试剂盒包括：1)用牛结合珠蛋白HP抗体包被的酶标板2)牛结合珠蛋白HP标准品3)标准品稀释液4)牛结合珠蛋白HP抗体5)酶标记的羊抗鼠IgG抗体6)洗涤液7)底物8)显色剂9)终止液。该试剂盒通过下述方法获得1.牛结合珠蛋白基因（GeneBankIDNM_001040470.2）通过PCR扩增后，克隆到表达载体PET28中，将其转化大肠杆菌BL21后，通过IPTG诱导表达，得到重组的牛结合珠蛋白HP2.将重组的牛结合珠蛋白纯化后HP，免疫小鼠，通过细胞融合和筛选后，制备得到HP的单克隆抗体3.利用纯化的牛结合珠蛋白单克隆抗体和重组牛结合珠蛋白抗原通过下述方法制备酶联免疫试剂盒1)包被有牛结合珠蛋白抗体的酶标板制备w包被将牛结合珠蛋白抗体用PH6-8的0.01-0.05MPBS缓冲液稀释，终浓度为1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶标板的微孔中。在37℃孵育1-4小时或者4℃孵育过夜；w洗涤用0.01-0.05M的PBS缓冲液，加入0.1%的Tween20洗涤酶标板3-5次；w封闭在上述酶标板中每孔加入300ul封闭液（10%小牛血清或者3%脱脂奶粉）室温封闭1-3小时；w洗涤用0.01-0.05M，PH6-8的PBS缓冲液加入0.1%Tween20缓冲液洗涤酶标板3-5次；w干燥在20-37℃干燥5-10小时，使酶标板干燥。干燥后就得到包被有牛结合珠蛋白抗体的酶标板2)标准品稀释液配制配制0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS，调节PH至PH7.43)牛结合珠蛋白HP标准品配制将重组表达纯化的牛结合珠蛋白用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4溶解，配制终浓度为10ug/ml的牛结合珠蛋白标准品4)牛结合珠蛋白抗体配制牛结合珠蛋白单克隆抗体用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4溶解，配制终浓度为10ng/ml的牛结合珠蛋白标准品5)酶标记的羊抗鼠IgG抗体配制将HRP标记的羊抗鼠IgG用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4做1:10000稀释6)洗涤液配制在0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4中加入0.1%的Tween207)底物液配制过氧化氢脲用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4溶解，终浓度为1mg/ml8)显色液配制四氨基联苯胺TMB用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBSPH7.4溶解，终浓度为0.1mg/ml，使用前底物液和显色液1:1混合，配制显色底物9)终止液配制2mol/LH2SO4。该试剂盒使用方法如下:1.结合珠蛋白标准品配制w取6支离心管，编号A、B、C、D、E和F；w管F中取900µL标准品稀释液，加入100µL试剂盒中的结合珠蛋白标准品（10ug/mL）混匀，配制1ug/ml标准品；w管E中取500µL标准品稀释液，加入500µL校准品F，混匀，作1:2稀释，配制成校准品E；w管D中取500µL标准品稀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：用牛结合珠蛋白HP抗体包被的酶标板牛结合珠蛋白HP标准品标准品稀释液牛结合珠蛋白HP抗体酶标记的羊抗鼠IgG抗体洗涤液底物显色剂终止液。

【技术特征摘要】
1.一种检测奶牛隐性乳房炎的酶联免疫试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：用牛结合珠蛋白HP抗体包被的酶标板牛结合珠蛋白HP标准品标准品稀释液牛结合珠蛋白HP抗体酶标记的羊抗鼠IgG抗体洗涤液底物显色剂终止液。2.根据权利要求1所述的酶标板，其特点在于酶标板的材质为聚苯乙烯微孔板。3.根据权利要求1所描述的酶标板，其特征在于酶标板制备方法包括以下步骤包被：将牛结合珠蛋白抗体用PH6-8的0.01-0.05MPBS缓冲液稀释，终浓度为1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶标板的微孔中，在37℃孵育1-4小时或者4℃孵育过夜洗涤：用0.01-0.05M的PBS缓冲液，加入0.1%的Tween20洗涤酶标板3-5次封闭：在上述酶标板中每孔加入300ul封闭液（10%小牛血清或者3%脱脂奶粉）室温封闭1-3小时洗涤：用0.01-0.05M，PH6-8的PBS缓冲液加入0.1%Tween20缓冲液洗涤酶标板3-5次干燥：在20-37℃干燥5-10小时，使酶标板干燥。4.根据权利要求3所描述的酶标板制备方法，其特征在于，包被酶标板的牛结合珠蛋白抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，其中优选单克隆抗体。5.根据权利要求1所描述的牛结合珠蛋白标准品，其特征在于所用的牛结合珠蛋白可以是天然的牛结合珠蛋白也可以是重组表达的牛结合珠...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，
申请(专利权)人：北京美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11