特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术公开一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用。该引物对是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列设计的特异性PCR引物对，其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。本发明专利技术能够特异性检测柑橘螺原体(Spiroplasma citri)，无需进行螺原体的分离培养，可以直接从柑橘总DNA中检测病原。本发明专利技术检测灵敏度高，可检测低至10

【技术实现步骤摘要】
特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用
本专利技术涉及一种外来入侵植物病害的检测技术，特别涉及一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用。
技术介绍
螺原体是一种直径约为100～250nm，基本形态为螺旋形的无细胞壁的原核微生物。1973年建立了螺原体属(Spiroplasma)，目前发现的螺原体，根据血清学特性将其分为34个血清组，并已确立了37个螺原体种。螺原体和宿主的关系可分为共生(Mutualism)、互生(Commensalism)和致病(Pathogenic)3种，其中致病螺原体可导致蜜蜂的“五月病”和“爬蜂病”，虾蟹颤抖病，柑橘僵化病(Citrusstubborn)、玉米矮缩病等，对蜜蜂业、水产养殖业和农业生产造成严重影响。植物螺原体主要存在于植物筛管部和吸食植物汁液的昆虫体内，这些昆虫只是螺原体传播的媒介，绝大多数植物病原性的螺原体对介体昆虫并不致病。柑橘僵化病是由韧皮部限制的螺原体(Spiroplasmacitri)引起的，田间通过柑橘叶蝉传播的。病原感染大多数柑橘品种和栽培品种，主要分布在热带和干旱的柑橘种植区，包括美国加利福尼亚、亚利桑那州，北非，东地中海盆地和中东。受侵染的柑橘导致严重发育不良，叶片致密且异常直立，叶片褪绿，类似营养缺乏症状，后期造成严重的产量损失。螺原体由于没有细胞壁、个体微小，相比于其它微生物，螺原体的分离、显微镜检查等方法都比较困难，国内除王文等对虾蟹中的螺原体研究较深入外，其它种类螺原体仅限于分离鉴定和生物学特性的研究。2004年王文等基于细菌16SrDNA，利用PCR技术检测河蟹颤抖病的病原，研究发现病原是一个螺原体新种，命名为中华绒螯蟹螺原体；2012年李霞等利用细菌的16SrDNA通用引物扩增并测序比对，检测到蜜蜂中的一株新的致病螺原体。目前螺原体的检测主要是基于细菌的16SrDNA序列，首先需要进行螺原体的培养，再提取螺原体的DNA，然后利用细菌通用引物进行PCR扩增，最后需要进一步的测序比对验证试验结果。为进一步提高特定螺原体的检测效率和灵敏度，还需要探索寻找其它基因或核酸片段应用于特定螺原体的特异检测，无需进行繁琐的螺原体培养过程，直接从宿主总DNA中特异检测螺原体病原。柑橘螺原体已经列入中国外来入侵物种数据库，柑橘僵化病在国内尚未见田间报道，随着全球经济一体化进程加快，需要加强对外来柑橘病害的检疫检测，一套良好的柑橘螺原体检测方案对病原体的检测以及病害的预防和控制都非常重要。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对。本专利技术的另一目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供上述特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对或试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对，该引物对是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasmacitri)的膜蛋白基因序列设计的特异性PCR引物对，其序列如下：上游引物Scf：5'-CACCTGCAACTGTAGCAACA-3'；(SEQIDNo：1)下游引物Scr：5'-TGCAGCATTCATCCCTTGTG-3'。(SEQIDNo：2)本专利技术还提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒，包括上述引物对。所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对在柑橘僵化病病原检测中的应用。所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒在柑橘僵化病病原检测中的应用。一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的方法，包括如下步骤：(1)提取柑橘基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的柑橘基因组DNA为模板，利用SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所述的引物对进行PCR反应；(3)将步骤(2)得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；若扩增到目标条带，则为阳性，即感病；若未扩增到任何条带，则为阴性，即健康。所述的柑橘基因组DNA采用改良的CTAB法提取柑橘基因组DNA，包括如下步骤：(1)取柑橘病叶200mg，置于研钵中加液氮研磨成粉状；(2)迅速加入65℃预热的抽提缓冲液2×CTAB(2％CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCL，pH8.0，用前加0.2％巯基乙醇)600μL，稍作研磨混匀；(3)研磨液转入1.5mL离心管中，65℃水浴30min，期间不时摇匀。(4)加入600μL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈振荡2分钟，12000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。(5)加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，温和混匀，12,000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。(6)加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，混匀，置-20℃20min。(7)4℃下12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇各洗一次，室温下风干，沉淀溶于200μLTE(100mmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，pH8.0)中保存。所述的PCR反应体系，如下：所述的PCR反应条件，如下：所述的目的条带为扩增的柑橘僵化病病原(Spiroplasmacitri)的膜蛋白基因序列，如SEQIDNo：3所示：(818bp)CACCTGCAACTGTAGCAACAGCAAACCCAAAACAAGTTACAAACGCTGAAATTAAAACAGCGTTAGAAGCTAATGTTTTAAAAGCAGTGCAAGGAGTTGTAAAAACAGCAACAGCAGCTGATTTTCAATTTGATGTTTATCAAGACAACGAAGGTACATCATTAACAACAATTAATTTACAAGGAGGTAACGTTGAAGTTTATGTTCAAATTACTCCAGCAAAAGATAAAACTGTTGTTATTGGTAAAACAGGATACATTAAAGTAACTTTACCAAAAATAAAAGTAGATATTTCAAGTGTAGTAATAAATCAACAAATTGTAGAAATTAAAGCAGCAGACCCAAAACAAGTTACAAAAGATGAGTTAAATGCAGTTAATACTTATGCAACTCTTGCAAGTGCTGTTTTAGAGGCTATAAAAAATAAAGCACCAAATGCAGGAGCAAGTGATTTTGAAATTACAAATAATTGTGATGCGGGAAACTATTCAGAACAAAAAGATGTTAAAGTAACAGTTAAAGCAAAAGATGAATCACCAAACATTTCTGGTGAATTTAAAGTTAATGCAAAAGTAAAAGCTATATTAGCACCAGCAAATGCAGGATAAGAATTAACTTTTTCTTATTTAGAACAAAATAAAAAACACTTATTAAAGTGTTTTTTATGTTTTTTAGTTAAAAAAATCTTTACAATCTTAGAATATCAACTAAAATTAATATAAACAAGATAAAACAAGCAAAAGAGAAGGAGAAAAAGCATGCTTAAAAAAATTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对，其特征在于该引物对的序列如下：上游引物Scf：5'‑CACCTGCAACTGTAGCAACA‑3'；下游引物Scr：5'‑TGCAGCATTCATCCCTTGTG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对，其特征在于该引物对的序列如下：上游引物Scf：5'-CACCTGCAACTGTAGCAACA-3'；下游引物Scr：5'-TGCAGCATTCATCCCTTGTG-3'。2.一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对。3.权利要求1所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对在柑橘僵化病病原检测中的应用。4.权利要求2所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒在柑橘僵化病病原检测中的应用。5.一种特异性快速检测柑...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓兵，彭埃天，崔一平，程保平，凌金锋，陈霞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44