一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统及其应用，所述表达系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、核定位序列NLS、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2‑BD、CIB1‑VP64‑NLS、UAS‑外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。本发明专利技术以单色光‑蓝光作为诱导外源基因表达的诱导因素，克服了热激诱导对藻细胞的伤害,也克服了各种化学诱导剂对藻细胞代谢的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及利用蓝光诱导的外源基因表达系统及其在衣藻基因表达调控和转基因衣藻生物反应器中的应用。
技术介绍
转基因技术是二十世纪七十年代在大肠杆菌中最早发展起来的，随着分子生物学的快速发展，外源基因的高效表达已经能为基因工程药物及工农业原料等重要的生产途径。藻类由于既具有微生物快速生长的特性又能通过光合作用合成目标产物，非常适合构建转基因藻类生物反应器。莱茵衣藻是少数三套基因组均能进行遗传转化的生物【Lumbreras,V.,Purton,S.,1998.RecentadvancesinChlamydomonastransgenics.Protist149,23–27】，其生长周期短，光合效率高，具有“光合酵母”之称，能在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代。然而，由于莱茵衣藻核基因组具有GC含量高（约62％）、密码子高度偏爱等特点[HarrisEH(1989).TheChlamydomonasSourceBook:AComprehensiveGuidetoBiologyandLaboratoryUse.AcademicPress,SanDiego,California],尽管大量的莱茵衣藻外源基因表达系统已经报道，但这些系统均还存在一定的局限性。最早利用莱茵衣藻核遗传系统进行转化是利用nit1基因来修复nit1基因突变株，（KindleKL,SchnellRA,FernandezE,LefebvrePA.1989.StablenucleartransformationofChlamydomonasusingtheChlamydomonasgenefornitratereductase.JCellBioi109:2589-2601），随后使用SV40和CaMV35S启动子在衣藻中表达基因的效率较低，甚至是出现“基因沉默”现象。采用内源的启动子如RBCS2、NIT可以使基因的表达水平得到大大的改善。VictoriaLumbreras等（1998）实验表明，删减RBCS2启动子上游序列约440bp后可使ble化效率提高3倍，但不能提高ble基因的表达效率，可能是被删除的序列里有负调节元件，影响了ble基因在基因组的插入和稳定【LumbrerasV.,StevensD.andPurtonS.1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ.14,441-448】。RBCS2-HSP70是目前应用比较广泛的启动子，它是1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子与热激蛋白70的嵌合型启动子，在强光和热激诱导的情况下，能高效诱导外源基因的表达【ChaogangWang,ZhangliHu,AnpingLei,BaohuiJin.Biosynthesisofpoly-3-hydroxybutyrate(PHB)intransgenicgreenalgaeChlamydomonasreinhardtii.JournalofPhycology,2010,46:396-402.】，但无论是强光照射还是热激处理都会严重影响藻细胞的生长状态，且热激处理不适宜大规模培养藻类的诱导处理。蓝光是指波长在475-495nm的光，利用植物中的蓝光受体及相互作用蛋白可以构建基于蓝光诱导的基因表达系统，该系统已经在动植物细胞中广泛使用[SilvanaKonermann,MarkD.Brigham,AlexandroE.Trevinoetal.Nature,2013,50(22):472-476]，但在藻类细胞中还没有开发基于蓝光诱导调控的转基因系统。
技术实现思路
本专利技术创造性地将酵母双杂交技术手段与蓝光受体及相互作用蛋白整合在一起，专利技术了一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统。本专利技术采用的技术方案为：一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统，该系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、核定位序列NLS、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2-BD、CIB1-VP64-NLS、UAS-外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。本专利技术所述的基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4转录因子的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2-BD、CIB1-VP64、UAS-外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。莱茵衣藻表达的CRY2-BD融合蛋白结合在转基因藻核基因组DNA的UAS序列上，形成包括CRY2-BD融合蛋白和UAS-外源基因序列组成的复合体)，而CIB1-VP64-NLS融合蛋白则游离于核质中；当蓝光照射时，由于CRY2与CIB1发生相互作用，使游离于核质中的CIB1-AD也结合在UAS上，形成VP64-CIB1与CRY2-BD及UAS-外源基因组成的复合物,VP64能激活UAS下游的外源基因表达。当停止蓝光照射时，CIB1与CRY2分离，VP64就不能激活UAS下游的外源基因表达。利用该系统表达的外源基因可以是功能基因，也可以是调控基因，该系统能有效地应用于衣藻细胞基因的表达调控。本专利技术专利的有益效果包括：(1)以单色光-蓝光作为诱导外源基因表达的诱导因素，克服了热激诱导对藻细胞的伤害,也克服了各种化学诱导剂对藻细胞代谢的影响;(2)藻细胞对蓝光的响应时间短,当蓝光诱导终止,外源基因表达很快停止,有利于进行衣藻基因表达的可逆调控;(3)蓝光诱导操作简单,不需要对诱导物质进行分离纯化,大大降低转基因衣藻生物反应器的生产成本。附图说明图1为基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统构建示意图；图中：5’RBCS2是载体抗性基因的启动子；ble和Hyg分别代表博来霉素（zeocin）和潮霉素（Hygromycin）的抗性筛选标记基因。图中展示了载体改造，抗性替换，及最终所需两个载体的构建过程。箭头指向带字母的框表示通过酶切和连接的步骤将箭头平端连接的片断替换为箭头所指的片断。箭头指向横线表示将所示片断插入箭头所指示的位置。图2为基于蓝光诱导表达荧光素酶基因的转基因衣藻的转化与筛选流程示意图；图中：抗性筛选步骤中培养皿上所示圆形绿点为单克隆藻株。“筛选到的转基因藻株实例”一图为筛选到含有两个质粒抗性的转基因藻株的培养皿，图中最后一个培养皿箭头指示了部分阳性单克隆。图3为报告基因在莱茵衣藻中蓝光诱导表达效果示意图；图中：对在红光下生长到对数生长期的藻液进行连续两天的蓝光诱导：第一天在纯蓝光下诱导8小时，然后放回红光下恢复16小时；第二天在白光下再次持续诱导12小时。柱形图以作为报告基因的外源表达调控序列的调控效果作为报告基因表达水平的标志，将CC-849未经蓝光诱导的样本设定为1，则纵坐标为相对表达效果，横坐标为处理时间，单位为小时，虚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统，其特征在于：该系统的元件包括光受体隐花色素 CRY2基因及其相互作用蛋白 CIB1基因、GAL4的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64 、核定位序列NLS、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2‑BD、CIB1‑VP64 ‑NLS、UAS‑外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。

【技术特征摘要】
1.一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统，其特征在于：该系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、核定位序列NLS、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2-BD、CIB1-VP64-NLS、UAS-外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。2.如权利要求1所述的基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统，其特征在于：所述该系统表达的外源基因为功能基因，或者为调控基因。3.如权利要求1所述的基于蓝光诱导的衣藻外...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉婷，蒋欣芩，李辉，胡章立，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44