本发明专利技术提供了一种β1-AA单克隆抗体，所述单克隆抗体利用以下两条多肽作为免疫原产生，多肽1：序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85％至100％的多肽；多肽2：序列与CHWWRAES?DEARR同一性为85％至100％的多肽。本发明专利技术使用两条肽段进行免疫，其中多肽1段为β1肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，但免疫原性较低；而多肽2段为针对多肽1段设计的免疫原性较高的肽段。因此，用这两条肽段分别免疫，在保证获得正确抗体的同时也提高了免疫原性。针对β1肾上腺素受体细胞外第二环、且与临床病人血清中存在的β1-AA具有相同的生物学效应的单克隆抗体首次制备成功，使用该单克隆抗体进行科学研究可以得到更可靠的实验结果。
【技术实现步骤摘要】
—种诱导心肌细胞凋亡的β1肾上腺素受体单克隆抗体
本专利技术属于免疫学领域，涉及一种新型的导心肌细胞凋亡的β I肾上腺素受体单克隆抗体。
技术介绍
P1肾上腺素受体自身抗体是一种针对P1肾上腺素受体细胞外第二环产生的自身抗体，它主要存在于扩张性心肌病、恰加斯病以及心衰等多种心血管疾病中。研究发现，β !肾上腺素受体自身抗体对于研究心血管疾病的免疫学机制具有重要意义，且该自身抗体可以直接诱导心肌细胞发生凋亡(Daniel Jane-wit等，Betal-adrenergic receptorautoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonisticalIy inducingcardiomyocyte apoptosis.Circulation.2007 ；116:399-410.)。以往的研究中运用的自身抗体多为从血清中获得的多克隆抗体。通过纯化抗体分子可提高多克隆抗体的滴度。根据抗体与靶分子的相互作用，将抗体从蛋白质混合物中分离出来。已经有人采用MAb Trap Kit试剂盒，从β 1_ΑΑ为阳性的血清中提纯总IgG，虽然其中以抗β ^AR抗体为主，并可以通过β丨-AR特异性阻断剂metoprolol和人工合成的β ^AR-EC11抗原肽段间接验证效应主要是由抗P1-AR抗体引起(Antonio S.Tutor等.2007.Ant1-β 1-adrenergic receptor autoantibodies are potent stimulators ofthe ERK1/2 pathway in cardiac cells.Cardiovascular Research76:51-60.)。该方法提纯的抗体为血清中 总的IgG，并不是特异针对P1肾上腺素受体细胞外第二环，无法排除其他IgG的干扰。还有一种方法从血清中提纯总的IgG，经过挂有β !-AR-EC11抗原肽段的特异性亲和柱，以便提纯血清中高纯度的抗β !-AR抗体(Wallukat G等1995.Ant1-beta1-adrenoceptor autoantibodies with chronotropic activity fromtheserum of patients with dilatedcardiomyopathy:mapping of epitopes inthe firstand second extracellular loops.J Mol Cell Cardiol.27 (I):397-406)。通过此方法虽能得到特异性针对P1-AR-EC11的抗体，但得到的β「ΑΑ的浓度过低无法进行后续实验，且经济成本太高,因此,该技术应用并不广泛。
技术实现思路
为了解决现有技术中的上述问题，本专利技术构建一种针对β rAR细胞外第二环并且与心衰患者血清中的β !-AA具有相同生物学效应的新型β !-AA单克隆抗体。该新型β rAA单克隆抗体通过以下方法获得:首先设计合成抗原肽段，并将肽段进行偶联；免疫小鼠，获得血清；监测血清，制备单克隆杂交瘤细胞株；筛选特异性单克隆抗体，选取杂交瘤细胞株扩大培养，接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。该抗体以单一的亲和性和特异性与β !肾上腺素受体细胞外第二环结合，可有效排除其他抗体的干扰，并且与临床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物学效应。因此，使用该单克隆抗体进行科学研究可以得到更可靠的实验结果。本专利技术使用了两条肽段进行免疫，其中多肽I段为β i肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，但免疫原性较低；而多肽2段为针对多肽I段设计的免疫原性较高的肽段。因此，用这两条肽段分别免疫，在保证获得正确抗体的同时也提高了免疫原性。针对β I肾上腺素受体细胞外第二环、且与临床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物学效应的单克隆抗体首次制备成功。【附图说明】图1: β「AR细胞外第二环的单克隆抗体的构建。图1的A显示了 ELISA检测杂交瘤细胞上清液中β rAA的含量,其中，< 0.01vs载剂组；η = 3/组；图1的B显示了蛋白质印记检测β rAA单克隆抗体与H9C2细胞表面β rAR的结合，η = 3，其中β rAA是制备合成的β rAA单克隆抗体。图2:激光共聚焦技术检测β 1-AA单克隆抗体与心肌细胞的表面的β ι-AR的结合情况。图3:乳鼠心肌细胞跳动频率实验检测P1-AA单克隆抗体的功能，其中心衰病人载剂组是来自β rAA阴性心衰病人血清中的总IgG，η = 3 ;心衰病人β rAA组是来自β j-AA阳性心衰病人血清中的总IgG,η = 3 ;单克隆抗体载剂组是生理盐水对照组,η = 3 ；单克隆抗体β rAA组是制备合成的β ι_ΑΑ单克隆抗体，η = 3。图4 J1-AA单 克隆抗体诱导心肌细胞H9C2凋亡，A是细胞流式结果图(各小图右下象限结果为凋亡率)，Β是统计柱状图，图中#Ρ < 0.01vs.载剂组；η = 4/组；其中对照组为溶剂对照组，β rAA组为β rAA刺激组，肽组为β !-AR-EC11肽段组，上清组为β rAA和^1-AR-EC11共同刺激组。【具体实施方式】本专利技术的新型P1-AA单克隆抗体通过包括以下步骤的方法制备:1.抗原多肽的合成；2.利用所合成的抗原多肽通过杂交瘤细胞融合的方法制备单克隆抗体。本专利技术中，抗原多肽的合成可以为以下合成:根据人β !肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，合成两条抗原肽段，其中多肽1:序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85%至100%的多肽；多肽2:序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽。本专利技术所用的两条抗原肽段中，多肽I为序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85%至100%的多肽，优选90%至100%，更优选95%至100% ;多肽2序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽，优选90%至100%，更优选95%至100%。将合成的多肽用于杂交瘤细胞融合的方法来制备单克隆抗体:1)将多肽I和多肽2分别偶联至载体蛋白KLH、BSA作为免疫原；2)使用偶联制备的两种免疫原分别免疫多只小鼠，制备多抗血清；3)以多抗血清进行生物活性验证；4)选择其中滴度最高的1-2只小鼠，分别进行融合，制备单克隆杂交瘤细胞株；5)对所获得的杂交瘤细胞通过ELISA方法进行筛选，挑选出I~5株高亲和力的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，并将其扩大培养；6)挑选的I株克隆，接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。用ELISA、蛋白质印记及激光共聚焦技术检测β rAA单克隆抗体与细胞表面β !-AR的结合。杂交瘤技术是1975年k0hler和miIstein首先报道的，他们用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(srbc)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立起第一个b细胞杂交瘤细胞株，并成功地制得抗srbc的单克隆抗体(monoclonal antibody, mcab)。迄今世界已研制成数以千计的mcab。采用杂交瘤技术获得的单克隆抗体的理化性状高度均本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β1?AA单克隆抗体，所述单克隆抗体利用以下两条多肽作为免疫原产生，多肽1：序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85％至100％的多肽；多肽2：序列与CHWWRAES?DEARR同一性为85％至100％的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种P1-AA单克隆抗体，所述单克隆抗体利用以下两条多肽作为免疫原产生， 多肽 1:序列与 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC 同一性为 85%至 100%的多肽； 多肽2:序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽。2.如权利要求1所述的β「ΛΑ单克隆抗体，所述抗体通过杂交瘤融合方法制备。3.如权利要求2所述的P1-AA单克隆抗体，所述杂交瘤融合方法包括以下步骤: 1)将多肽I和多肽2分别偶联至载体蛋白KLH、BSA作为免疫原； 2)使用步骤I...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧荣，杜芸辉，李笑，张苏丽，商建宇，马新亮，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：
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