【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于癌症发病相关基因检测领域，更具体地说是本专利技术以fam124a基因在多发性骨髓瘤病人外周血中明显上调表达为基础，涉及一种基于fam124a基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒及fam124a基因在制备多发性骨髓瘤诊断试剂盒中的应用，本专利技术也涉诊断多发性骨髓瘤的方法。
技术介绍
1、多发性骨髓瘤被认为是浆细胞恶性增殖性疾病，其特征是浆细胞不受控制的增殖和单克隆抗体的产生。多发性骨髓瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是b淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。因此多发性骨髓瘤可以归到b淋巴细胞淋巴瘤的范围。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（m蛋白）过度生成，极少数患者可以是不产生m蛋白的未分泌型mm。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。
2、多发性骨髓瘤发病率估计为2～3/10万，男女比例为1.6：1，大多患者年龄>40岁。近年来，临床调查发现多发性骨髓瘤发病率显著增加。据估计，2020年美国的发病率高达4-6/10万例，新增病例32270例，死亡报告12830例，其中非洲裔美国人的发病率是欧洲裔美国人的2-3倍。
3、众所周知，多发性骨髓瘤和其他恶性疾病患者经历了从无症状到有症状的渐进过程，这也被称为非恶性到恶性阶段。这个渐进过程伴随着许多遗传基因的表达改变。通过与多发性骨髓瘤相关基因表达的检测，可以给多发性骨髓瘤进行早期诊断提供依据，制备以相应基因为基础的检测方法。
4、然而，
5、本专利技术通过对健康人和多发性骨髓瘤病人临床样本进行高通量mrna表达谱测序分析，发现fam124a是多发性骨髓瘤患者中一个高度表达的新基因。我们前期实验研究表明，fam124a基因过表达可以促进多发性骨髓瘤细胞增殖和小鼠体内移植瘤的发生、发展。因此，该基因可能成为多发性骨髓瘤一个新的诊疗靶点。
技术实现思路
1、为了弥补现有多发性骨髓瘤诊断靶点的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于fam124a基因的定量聚合酶链式反应（qpcr）扩增试剂盒及其在多发性骨髓瘤诊断中的应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术通过对健康人和多发性骨髓瘤病人外周血细胞样本进行高通量mrna表达谱测序分析，发现fam124a是多发性骨髓瘤患者中一个高度表达的新基因。通过检测fam124a基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有多发性骨髓瘤。
4、由于fam124a基因的在多发性骨髓瘤患者外周血细胞样本中转录水平较健康人外周血细胞样本明显升高，可以根据这一特点，以fam124a基因为基础为制备基于fam124a基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒提供依据。fam124a基因在制备基于fam124a基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于所述诊断试剂盒包含使用qpcr扩增fam124a基因用的引物对，所述引物分别为：
5、上游引物序列：5’-ctgcagccaggacttcttca-3’，如seq id no：1所示；
6、下游引物序列：5’-gtcgtagcgacagtagacgg-3’，如seq id no：2所示。
7、本专利技术的另一目的是提供一种基于fam124a基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒，所述试剂盒包含qpcr扩增fam124a基因用的引物，引物可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中所述引物分别为：
8、上游引物序列：5’-ctgcagccaggacttcttca-3’，如seq id no：1所示；
9、下游引物序列：5’-gtcgtagcgacagtagacgg-3’，如seq id no：2所示。
10、所述诊断试剂盒还包含管家基因β-actin引物，引物对可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中所述引物分别为：
11、上游引物序列：5’-ctcgcctttgccgatcc-3’，如seq id no：3所示；
12、下游引物序列：5’-ggggtacttcagggtgagga-3’, 如seq id no：4所示。
13、所述诊断试剂盒还包含qpcr扩增反应体系，所述qpcr扩增反应体系包含sybrgreen荧光染料、pcr缓冲液、dntps。
14、上述技术方案中，所述pcr缓冲液为本领域的公知现有技术，优选地，pcr缓冲液包含：200 mm (nh4)2so4、20mm kcl、2.5mm mgcl2。
15、在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含m-mlv逆转录体系，该逆转录体系包含：、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps、oligo(dt)。
16、优选逆转录反应液包含： 15 mm的mgcl2、370 mm的kcl、250 mm ph8.3的tris-hcl、50 mm的dtt。
17、rna酶抑制剂可选用本领域常用的rna酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的重组rna蛋白酶抑制剂。
18、在本专利技术的一个具体的实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含rna提取试剂，rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
19、本专利技术的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
20、本专利技术还提供了诊断多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括：
21、(1) 利用rna提取试剂提取样本总rna；
22、(2) 将步骤(1)获得的rna逆转录成cdna；
23、(3) 在qpcr仪上将fam124a基因和管家基因进行扩增；
24、(4) 通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量；
25、(5) fam124a基因表达升高，表明研究对象为多发性骨髓瘤患者。
26、本专利技术的优点和有益效果在于：
27、（1）本专利技术首次发现了fam124a与多发性骨髓瘤的关系，通过检测受试者中fam124a基因表达的水平，可以判断其是否患有多发性骨髓瘤，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；
28、（2）本专利技术首次为以fam124a基因为靶点在制备诊断试剂盒或治疗试剂等方面提供依据；
29、（2）本专利技术发现fam124a 诊断试剂盒诊断多发性骨髓瘤，相比现有的诊断手段，该方法准确性高、副作用低，有利于实现多发性骨髓瘤的早期筛查及准确判断是否多发性骨髓瘤。
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1.一种基于FAM124A基因的定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增试剂盒在多发性骨髓瘤诊断中的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒包含可用于扩增FAM124A基因的qPCR引物，所述引物分别为：
2.一种基于FAM124A基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含FAM124A基因的qPCR引物，所述引物分别为：
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含管家基因β-actin引物对，所述引物分别为：
4.根据权利要求1-3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包qPCR的反应体系：SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs。
5.根据权利要求1-4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：200 mM(NH4)2SO4、20 mM KCL、2.5 mM MgCL2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系；所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸OligodT、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、
7.根据权利要求1-6中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
...【技术特征摘要】
1.一种基于fam124a基因的定量聚合酶链式反应（qpcr）扩增试剂盒在多发性骨髓瘤诊断中的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒包含可用于扩增fam124a基因的qpcr引物，所述引物分别为：
2.一种基于fam124a基因的多发性骨髓瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含fam124a基因的qpcr引物，所述引物分别为：
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含管家基因β-actin引物对，所述引物分别为：
4.根据权利要求1-3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包qpcr的反应体系：sybr green荧光染料、pcr缓冲液、dntps。
5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：王仁喜，粟文婷，周珊，朱改只，徐雅琪，高冉，张敏，曾琦，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：
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