本发明专利技术属于生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。本发明专利技术选取当前PEDV新流行毒株的S1基因和M基因为参考序列，采用杆状病毒表达系统表达S1蛋白或部分S1蛋白和M蛋白，将获得的重组蛋白制备成亚单位疫苗，用于有效控制猪流行性腹泻的发生。本发明专利技术所述方法制得的猪流行性腹泻基因工程亚单位疫苗解决了目前猪流行性腹泻病毒传统疫苗存在的缺陷，可用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染及其引起的相关疾病，也同样适用于制备检测猪流行性腹泻病毒抗体ELISA试剂盒的包被抗原。
【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
本专利技术属于生物疫苗制备
，具体涉及一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一种急性高度接触性肠道传染病，由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起,其临床特征为水样腹泻、呕吐和脱水。各日龄的猪均易感，尤其是哺乳仔猪。PED在世界范围内广泛分布，英国、比利时、法国、匈牙利、加拿大等国相继报道了本病的发生。据报道，PED近几年在亚洲国家发生相当严重，日本、韩国、泰国均出现过大流行，并且死亡率高，危害严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。我国于1980年首次分离到PEDV，以后许多地区相继报道有本病发生，并主要在冬春季节散发造成的危害不大。从2010年至今，在我国华南、华北部分省份暴发了严重的猪流行性腹泻，已超过100万的仔猪死亡(Sun et al, 2012)。表现为7日龄内仔猪水样腹泻、呕吐、高死亡率，部分猪场反复感染一年四季均发病等新流行特点。此外，最新的研究表明还可能通过乳汁进行垂直传播。目前对于该病的防控主要采取传统的灭活苗、弱毒苗免疫接种，但产生的免疫保护力均达不到理想的效果。造成免疫失败的主要原因有:(1)病毒滴度低，导致抗原含量不足。PEDV难以分离培养，即使营养液中加入胰酶促使其在Veix)细胞中繁殖传代，但病毒滴度只能维持在IXlO3 c11TCID5cZml左右。(2)毒株变异。PEDV纤突蛋白(S蛋白)是诱导机体产生保护性中和抗体的免疫蛋白，由S基因编码。现已报道，当前我国新分离PEDV毒株S基因发生了变异，遗传进化树分析提示新分离毒株与泰国分离毒株关系较近，和疫苗毒株CV777遗传关系较远(刘孝珍等，2012)，我国目前传统PED疫苗都是采用该疫苗毒株。由于现有疫苗在防控PED方面效果不理想，使得PED的防控问题显得非常棘手。因此，研制一种安全、有效、价格合理的新型疫苗来控制该病的发生与流行已迫在眉睫。PEDV 属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。PEDV 主要的结构蛋白包括:核衣壳蛋白(N蛋白)是PEDV在感染细胞中产生最多的病毒蛋白，结构十分保守，故利用N蛋白来建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景；膜蛋白(M蛋白)是PEDV中含量最多的包膜蛋白，由226个氨基酸组成，有三方面的生物学作用--参与病毒粒子的组装和出芽、刺激机体产生a-干扰素(a-1FN)、其产生的抗体在补体存在时具有中和病毒的能力；纤突蛋白(S蛋白)是由S基因编码的位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用。S蛋白是由1384个氨基酸组成的多肽，含有27-29个潜在的糖基化位点，划分为2个功能区即SI (第1-789位氨基酸)和S2 (第790-1383位氨基酸)。现已研究证实在SI区中存在多个线性抗原表位，包括中和表位区(Chang S H et al.，2002;孙东波等，2007)。所以，M蛋白和S蛋白为PEDV基因工程疫苗、病毒侵入机制和诊断技术等方面研究中的重要靶蛋白。目前，研究者为了发挥SI蛋白和M蛋白能诱导产生抗体的特性，采用原核表达系统如大肠杆菌、乳酸菌、沙门氏菌为表达载体，表达SI区部分的抗原表位基因(刘邓等，2010 ;董丽娜等，2008;徐丽丽等，2011)。同时也有研究者采用大肠杆菌为载体表达M蛋白(高慎阳等，2007)。但上述表达策略均存在不足之处:S蛋白为糖基化蛋白，原核表达系统不能进行相应的修饰导致表达出的重组SI蛋白或者M蛋白的免疫原性差；表达量普遍不高导致有效抗原量含量偏低不足以制备成亚单位疫苗；都是采用单个表达，没有采用双表达系统同时发挥SI蛋白和M蛋白的生物学活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术选取部分SI基因或者是完整的M基因，采用原核表达系统进行表达存在的缺陷，提供一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗。本专利技术的另一目的是提供一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法。所述方法选取当前PEDV新流行毒株的SI基因和M基因为参考序列，采用杆状病毒表达系统表达SI蛋白和M蛋白，将获得的重组蛋白制备成亚单位疫苗，用于有效控制猪流行性腹泻的发生。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现: 一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤: 51.将猪流行性腹泻病毒的完整的SI蛋白的编码基因或猪流行性腹泻病毒的部分SI蛋白的编码基因Slp和完整M蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒Bv-Sl或重组杆状病毒Bv-Slp-M ； 52.将重组杆状病毒Bv-Slp-M或重组杆状病毒Bv-Sl进行扩大培养，纯化回收获得SI蛋白或Slp蛋白和M蛋白； 53.将SI蛋白或Slp蛋白和M蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后即可获得组杆状病毒基因工程亚单位疫苗； 其中猪流行性腹泻病毒的部分SI蛋白的编码基因Slp的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；S1全基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。具体地，SI所述重组杆状病毒Bv-Sl的构建方法为:将猪流行性腹泻病毒的完整的SI蛋白的编码基因克隆到杆状病毒转移载体pFastbac-HTB中，得重组载体pFastbac-HTB-Sl ;重组载体pFastbac-HTB-Sl转化到预含有杆状病毒骨架质粒的DHlOBac感受态细胞中，通过同源重组后提取重组载体，重组载体再转染Sf9细胞产生重组杆状病毒 Bv-Sl。 具体地，SI所述重组杆状病毒Bv-Slp-M的构建方法为:将猪流行性腹泻病毒的部分SI蛋白的编码基因Slp和完整M蛋白的编码基因克隆到杆状病毒转移载体pFastbac-Dual中，得重组载体pFastbac-Dual-Slp-M ;重组载体pFastbac-Dual-Slp-M转化到预含有杆状病毒骨架质粒的DHlOBac感受态细胞中，通过同源重组后提取重组载体，重组载体再转染Sf9细胞产生重组杆状病毒Bv-Slp-M。S2所述扩大培养为:将密度为I~2X IO6细胞/mL的重组杆状病毒接毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞在含有0.1~0.5%的FBS或BSA的无血清培养基中，28°C培养72h。S2所述纯化回收为:离心回收S2扩大培养后的昆虫细胞，利用亲和层析介质N1-NTA进行纯化回收目的蛋白。优选地，S3所述佐剂为油乳佐剂或铝胶佐剂 如上所述方法制备得到的猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗。如上所述的猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗在防控猪流行性腹泻中的应用。 本专利技术的有益效果是: (I)本专利技术选取完整的SI蛋白基因和M蛋白基因，包含了完整的线性抗原表位(中和表位)，因此诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力强。获得的SI区基因为最新的流行毒株基因，与中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将猪流行性腹泻病毒的完整的S1蛋白的编码基因或猪流行性腹泻病毒的部分S1蛋白的编码基因S1p和完整M蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒Bv?S1或重组杆状病毒Bv?S1p?M；S2.将重组杆状病毒Bv?S1p?M或重组杆状病毒Bv?S1进行扩大培养，纯化回收获得S1蛋白或S1p蛋白和M蛋白；S3.将S1蛋白或S1p蛋白和M蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后即可获得组杆状病毒基因工程亚单位疫苗；其中猪流行性腹泻病毒的部分S1蛋白的编码基因S1p的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.将猪流行性腹泻病毒的完整的SI蛋白的编码基因或猪流行性腹泻病毒的部分SI蛋白的编码基因Slp和完整M蛋白的编码基因克隆到杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒Bv-Sl或重组杆状病毒Bv-Slp-M ； 52.将重组杆状病毒Bv-Slp-M或重组杆状病毒Bv-Sl进行扩大培养，纯化回收获得SI蛋白或Slp蛋白和M蛋白； 53.将SI蛋白或Slp蛋白和M蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后即可获得组杆状病毒基因工程亚单位疫苗； 其中猪流行性腹泻病毒的部分SI蛋白的编码基因Slp的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.根据权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，SI所述重组杆状病毒Bv-Sl的构建方法为:将猪流行性腹泻病毒的完整的SI蛋白的编码基因克隆到杆状病毒转移载体pFastbac-HTB中，得重组载体pFastbac_HTB_Sl ;重组载体pFastbac_HTB_Sl转化到预含有杆状病毒骨架质粒的DHlOBac感受态细胞中，通过同源重组后提取重组载体，重组载体再转染Sf9细胞产 生重组杆状病毒Bv-Sl。3.根据权利要求1所述疫苗的制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄毓茂，谭博敏，项林盛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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