本发明专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，它是导入了L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea?ohmeri?NH-9，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。本发明专利技术还公开了上述谷氨酸脱羧酶重组菌构建方法和应用。本发明专利技术具有如下优势：（1）盐酸吡哆醛价格是5’-磷酸吡哆醛的一半，降低工艺成本；（2）酶活高，反应时间短，条件温和，底物浓度高达510g/L，产物γ-氨基丁酸浓度达352g/L；（3）细菌及旋转蒸发后的缓冲液均可重复利用，转化率100%，收率不低于99%；（4）工艺简便，绿色环保，且产品纯度99%以上。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，它是导入了L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea?ohmeri?NH-9，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。本专利技术还公开了上述谷氨酸脱羧酶重组菌构建方法和应用。本专利技术具有如下优势：（1）盐酸吡哆醛价格是5’-磷酸吡哆醛的一半，降低工艺成本；（2）酶活高，反应时间短，条件温和，底物浓度高达510g/L，产物γ-氨基丁酸浓度达352g/L；（3）细菌及旋转蒸发后的缓冲液均可重复利用，转化率100%，收率不低于99%；（4）工艺简便，绿色环保，且产品纯度99%以上。【专利说明】一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程
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技术介绍
Y-GABA是L-谷氨酸脱去α _羧基的产物(图1 )，其化学名称是Y-氨基丁酸(简称Y -GABA),分子式为NH2CH2CH2CH2C00H，极易溶于水，在溶液中能以可变的分子结构形式存在，可伸展成线状，也可形成类似脯氨酸的环状。Y-GABA是两性分子等电点7.3接近于生理PH值。成品是无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末。Y-GABA的用途广泛，可用于食品、饲料、医药和化工等行业中。它有如下生理功能:1安神、抗抑郁；2增强记忆力，提高脑功能；3促进生长激素分泌，防止肥胖；4健肝利肾，防止大肠癌变；5改善更年期综合症；6提高精子的受精率等。天然存在的Y -GABA的量供不应求，因此Y -GABA的生产得到关注。目前，Y -GABA的生产基本采用化学合成法、植物富集法和生物合成法，其中化学合成法成本较高且使用有毒试剂，安全性差，反应条件苛亥IJ，产品分离困难。植物富集法含量较低，反应液成分复杂，产物提取十分困难。生物合成法安全性高，反应条件温和，提取工艺简单，原料丰富，有显著优势，原理为:利用L-谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的作用下脱去α-羧基制备Y-GABA。但是不足之处是目前生物合成法中运用的微生物含有的L-谷氨酸脱羧酶的酶活较低且下游分离提纯困难。所以筛选具有相对高活力L-谷氨酸脱羧酶的微生物并通过分子生物学技术外源高效表达L-谷氨酸脱羧酶并简化分离工艺得到该领域学者、专家的关注，即酶催化法。目前利用酶催化法制备Y-GABA的报道中，因为具有L-谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌酶活相对较高，所以利用大肠杆菌制备的Y-GABA的产率和得率相对较高，并且所报道的L-谷氨酸脱羧酶的辅酶为5’ -磷酸吡哆醛，该辅酶是菌体自身携带。焦庆才等(CN200410064813.3)将Escherichia coliASl.505菌体加入含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸的混合液中，28-45 °下反应，等电点结晶和离子交换树脂相结合使用分离出产物Y -GABA和L-天冬氨酸。吴晓燕等(化工进展，2005, 8:889-892)转化DL-谷氨酸，50g/L底物需15h完全转化，生成D-谷氨酸和Y-氨基丁酸，使用的细菌是Escherichia coliASl.505。李永丰等(华东化工学院学报，1981，2:7-11 )，赵景联等(生物工程学报，1989，2:124-128)，张汝平等(长沙电力学院学报自然科学版，1998，4:433-435)均用固定化大肠杆菌细胞转化L-谷氨酸制备Y-GABA，固定化材料分别为海藻酸钠-戊二醛和海藻酸钙。其中，李永丰将固定化细胞加入PH4.0，底物浓度为5%的L-谷氨酸溶液中，5h转化率达100% ;赵景联使用的底物浓度为1%，间歇反应，5h转化率达100% ;张汝平将包埋后的大肠杆菌加入后道味精母液进行酶促反应，Y -GABA的收率为49.65%，纯度达98.94%。这些使用野生大肠杆菌制备Y-GABA的普遍存在以下几个问题:1)酶活力不高；2)反应周期长；3)产物浓度低；4)提取工艺仍然相对复杂。随着分子生物学的崛起，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株酶催化效率远远高于普通微生物；利用重组菌生产Y-GABA的工艺在国内报道尚少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种适合于大规模工业化生产的谷氨酸脱羧酶重组菌。 本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组菌的构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组菌在生产Y-GABA中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下:一种谷氨酸脱羧酶重组菌，所述谷氨酸脱羧酶重组菌，它是导入了 L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母(Kodamaeaohmeri) NH-9，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。上述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤:(I)以酵母Kodamaea ohmeri NH-9的基因组DNA作为模板,酵母属于真核微生物，一般L-谷氨酸脱羧酶来源是原核微生物，以包含BamH I和Xho I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增:引物1:5' -CGGGATCCATGTTACACAGGCAC-3'(下划线处为 BamH I 酶切位点)；引物2:5' -GCCGCTCGAGTCAACATGTTCCTCT-3'(下划线处为 Xho I 酶切位点)；PCR的扩增体系为:基因组DNA2y L，引物I和引物2各2yL，dNTP4 μ L，IOXTaq缓冲液(含 Mg2+) 5 μ L，Taq 酶 I μ L，ddH2034 μ L ；PCR反应程序为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，然后50°C退火lmin，72°C延伸lmin，循环25次；最后72°C延伸IOmin ；回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad ；(2)将重组质粒pET-gad转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布含25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，20g/L琼脂，pH7.0)，37°C培养12~16h得到单克隆；(3)挑取10个单克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl,pH7.0)中，37°C、200rpm培养12h后提质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，根据电泳结果判断含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的基因工程菌。上述谷氨酸脱羧酶重组菌在制备Y -氨基丁酸中的应用。具体方法是，将谷氨酸脱羧酶重组菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以I~10(v/v)%的接种量转接入发酵培养基中30~40°C发酵培养2~3h，再加入终浓度0.5~1.0mM的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)或终浓度2~5g/L的乳糖诱导，并置于20~25°C下诱导表达20~24h ;将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌泥，用pH3.8~4.6的醋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，它是导入了L?谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L?谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea?ohmeri?NH?9，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐虹，许露，顾峰，詹伊婧，李莎，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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