参与赖氨酸脱羧作用的多肽的表达及其方法和应用技术

表达质粒载体包含编码Ldc2多肽、其片段和/或其突变体的多核苷酸序列。骨架质粒能够在宿主细胞中自主复制。宿主细胞不是铜绿假单胞菌细胞。转化体用表达质粒载体转化。转化体不是铜绿假单胞菌。突变宿主细胞包含已整合入宿主细胞染色体的编码Ldc2多肽、片段和/或突变体的多核苷酸序列。多肽、片段和/或突变体包含Ldc2。非天然存在的多核苷酸和/或突变体编码包含Ldc2的多肽。利用所述转化体制备生物基尸胺及通过所述方法制备的生物基尸胺。利用生物基尸胺形成的聚酰胺及组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
尸胺是参与产生多种产物的平台化合物。尸胺可以通过微生物中的赖氨酸的脱羧作用合成。赖氨酸脱羧酶是通过从赖氨酸去除羧基来催化产生尸胺的酶。例如，在大肠杆菌(E.coli)中，尸胺是通过两种赖氨酸脱羧酶多肽CadA和LdcC直接从L-赖氨酸生物合成的。目前，尸胺的生物合成利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。在L-赖氨酸的发酵生产路径中，将赖氨酸脱羧酶，通常为CadA或LdcC，添加至赖氨酸生成细菌菌株(例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌)，以便将赖氨酸生物合成途径延长至尸胺生物合成途径。或者，对于体外酶催化，可以将细菌工程化或诱导以产生赖氨酸脱羧酶，通常为CadA或LdcC，然后其可以用于通过脱羧作用将赖氨酸转化为尸胺。但是，尸胺的生产目前是有限的并且导致低收率。因此，需要以较高收率生产尸胺的方法。专利技术概述本专利技术的一方面涉及一种多肽，其包含铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)多肽Ldc2的一个或多个突变体、由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)多肽Ldc2的一个或多个突变体组成、或者基本上由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)多肽Ldc2的一个或多个突变体组成。如本文所用，铜绿假单胞菌多肽Ldc2称作“铜绿假单胞菌Ldc2”、“Ldc2”或“Ldc2多肽”，并且具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。本专利技术的另一方面涉及编码一个或多个第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含一个或多个第二多肽、由一个或多个第二多肽组成或者基本上由一个或多个第二多肽组成，所述第二多肽选自Ldc2、Ldc2片段和Ldc2突变体，其中所述第一多核苷酸包含分别编码一个或多个第二多肽的一个或多个第二多核苷酸；当有多个第一多肽时，每个第一多肽可以相同或不同；当有多个第二多肽时，每个第二多肽可以相同或不同；当有多个第二多核苷酸时，每个第二多核苷酸可以相同或不同；所述一个或多个第一多肽可以单独表达或作为融合蛋白表达；并且当第二多肽为Ldc2时，至少一个相应的编码所述第二多肽的第二多核苷酸包含突变的铜绿假单胞菌ldc2基因、由突变的铜绿假单胞菌ldc2基因组成或者基本上由突变的铜绿假单胞菌ldc2基因组成。如本文所用，铜绿假单胞菌ldc2基因称作“铜绿假单胞菌ldc2”或“ldc2”，并且具有SEQIDNO:3的多核苷酸序列。ldc2突变体的实例编码Ldc2，并且可以是密码子优化的ldc2(例如，ldc2-co1(SEQIDNO:17))。本专利技术的另一方面涉及编码一个或多个第三多肽的第三多核苷酸，所述第三多肽包含一个或多个第四多肽、由一个或多个第四多肽组成或者基本上由一个或多个第四多肽组成，所述第四多肽选自Ldc2(SEQIDNO:4)、Ldc2的片段和Ldc2的突变体；其中所述第三多核苷酸包含分别编码一个或多个第四多肽的一个或多个第四多核苷酸；当有多个第三多肽时，每个第三多肽可以相同或不同；当有多个第四多肽时，每个第四多肽可以相同或不同；当有多个第四多核苷酸时，每个第四多核苷酸可以相同或不同；并且所述一个或多个第三多肽可以单独表达或作为融合蛋白表达。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含ldc2、由ldc2组成或者基本上由ldc2组成。本专利技术的另一方面涉及第一表达质粒载体，其包含编码一个或多个第五多肽的第五多核苷酸、由编码一个或多个第五多肽的第五多核苷酸组成或者基本上由编码一个或多个第五多肽的第五多核苷酸组成，所述第五多肽包含一个或多个第六多肽、由一个或多个第六多肽组成或者基本上由一个或多个第六多肽组成，所述第六多肽选自Ldc2、Ldc2的片段和Ldc2的突变体；以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒。在某些实施方案中，所述宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。本专利技术的另一方面涉及第二表达质粒载体，其包含编码一个或多个第七多肽的第七多核苷酸、由编码一个或多个第七多肽的第七多核苷酸组成或者基本上由编码一个或多个第七多肽的第七多核苷酸组成，所述第七多肽包含一个或多个第八多肽、由一个或多个第八多肽组成或者基本上由一个或多个第八多肽组成，所述第八多肽选自Ldc2、Ldc2的片段和Ldc2的突变体；以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒。在某些实施方案中，所述宿主细胞不是铜绿假单胞菌细胞。本专利技术的另一方面涉及在宿主细胞中包含所述第一表达质粒载体的第一转化体。在某些实施方案中，所述宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。本专利技术的另一方面涉及在宿主细胞中包含所述第二表达质粒载体的第二转化体。在某些实施方案中，所述宿主细胞不是铜绿假单胞菌细胞。本专利技术的另一方面涉及包含如本文公开的第一或第三多核苷酸的第一突变宿主细胞，其中所述第一或第三多核苷酸已整合入所述宿主细胞的染色体。在某些实施方案中，所述宿主细胞不是铜绿假单胞菌细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。本专利技术的另一方面涉及一种制备一个或多个第九多肽的方法，所述第九多肽选自Ldc2、Ldc2的片段和Ldc2的突变体，所述方法包括获得如本文所述的第一转化体、第二转化体或第一突变宿主细胞，在有效表达所述一个或多个第九多肽的条件下培养所述第一转化体、第二转化体或第一突变宿主细胞，以及收获所述一个或多个第九多肽。本专利技术的另一方面涉及一种制备尸胺的方法，所述方法包括培养如本文所述的第一转化体、第二转化体或第一突变宿主细胞，利用获得自培养第一转化体、第二转化体或第一突变宿主细胞的培养物对赖氨酸进行脱羧来制备尸胺，以及提取并纯化尸胺。本专利技术的另一方面涉及制备自如本文公开制备的生物基尸胺的聚酰胺和1,5-二异氰酸戊烷(1,5-diisocyanatopentane)及其组合物和制备方法。附图说明图1：利用国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)产生自对大肠杆菌蛋白CadA(高亮)的序列相似性搜索的蛋白树。图2：利用BLAST产生自对大肠杆菌蛋白LdcC(高亮)的序列相似性搜索的蛋白树。图3：用来构建包含具有SEQIDNO:1的序列的铜绿假单胞菌基因(此后“ldc1”)或根据本专利技术的实施方案的ldc2的重组表达质粒载体的聚合酶链反应(PCR)引物序列，以及用来构建SEQIDNO:5的启动子序列的引物序列(psyn-1和psyn-2)。图4：用来表达具有SEQIDNO:2的序列的铜绿假单胞菌蛋白(此后“Ldc1”)和根据本专利技术的实施方案的Ldc2蛋白的重组表达质粒载体图。A)pCIB10的载体图；B)pCIB45的载体图；C)pCIB46的载体图；D)pCIB47的载体图；以及E)pCIB48的载体图。图5：来自不同物种的赖氨酸脱羧酶多肽的一部分序列的序列比对，包括大肠杆菌LdcC、宋内志贺菌(Shigellasonnei)CadA、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)赖氨酸脱羧酶、大肠杆菌CadA和铜绿假单胞菌Ldc2，具有保守丝氨酸(方框区)。图6：来自不同物种的赖氨酸脱羧酶多肽的一部分序列的序列比对，包括大肠杆菌LdcC、宋内志贺菌CadA、肠道沙门氏菌赖氨酸脱羧酶、大肠杆菌CadA和铜绿假单胞菌Ldc2，具有保守天冬酰胺和丝氨酸(方框区)。专利技术详述以下描述为充分理解和实施本公开的实施方案提供具体细节。但是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在不是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细胞的宿主细胞中包含表达质粒载体的转化体，所述表达质粒载体包含：编码包含一个或多个第八多肽的一个或多个第七多肽的第七多核苷酸，所述第八多肽选自SEQ ID NO:4(Ldc2)的氨基酸序列、其片段及其突变体；以及能够在所述宿主细胞中自主复制的骨架质粒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在不是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细胞的宿主细胞中包含表达质粒载体的转化体，所述表达质粒载体包含：编码包含一个或多个第八多肽的一个或多个第七多肽的第七多核苷酸，所述第八多肽选自SEQIDNO:4(Ldc2)的氨基酸序列、其片段及其突变体；以及能够在所述宿主细胞中自主复制的骨架质粒。2.权利要求1的转化体，其中所述第七多核苷酸序列包含SEQIDNO:3(ldc2)的多核苷酸序列、其片段或其突变体。3.权利要求1的转化体，其中所述Ldc2突变体选自SEQIDNO:6(Ldc2S111C)、SEQIDNO:11(Ldc2N262T)、SEQIDNO:12(Ldc2K265N)、SEQIDNO:13(Ldc2S111C/N262T)、SEQIDNO:14(Ldc2S111C/K265N)、SEQIDNO:15(Ldc2N262T/K265N)和SEQIDNO:16(Ldc2S111C/N262T/K265N)的氨基酸序列。4.权利要求1的转化体，其中所述Ldc2突变体包含选自以下的一个或多个突变：在氨基酸位置111处至X的突变，在氨基酸位置262处至X’的突变和在氨基酸位置265处至X”的突变；X、X’和X”独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；并且条件是X不是丝氨酸，X’不是天冬酰胺，而且X”不是赖氨酸。5.权利要求1-4中任一项的转化体，其中所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。6.权利要求5的转化体，其中为在大肠杆菌细胞中的最佳多肽表达，所述第七多核苷酸序列经密码子优化。7.权利要求5的转化体，其中所述骨架质粒是大肠杆菌表达质粒载体。8.权利要求7的转化体，其中所述骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101和它们的任何衍生质粒。9.权利要求7的转化体，其中所述表达质粒载体进一步包含启动子多核苷酸序列，所述启动子多核苷酸序列包含SEQIDNO:5的多核苷酸序列，其位于多核苷酸序列的上游。10.权利要求1-4中任一项的转化体，其中所述宿主细胞为蜂房哈夫尼菌(H.alvei)细胞。11.一种表达质粒载体，其包含：编码包含一个或多个第八多肽的第七多肽的第七多核苷酸，所述第八多肽选自SEQIDNO:4(Ldc2)的氨基酸序列、Ldc2的片段和Ldc2的突变体；以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒；其中所述宿主细胞不是铜绿假单胞菌细胞。12.权利要求11的表达质粒载体，其中所述Ldc2的突变体选自SEQIDNO:6(Ldc2S111C)、SEQIDNO:11(Ldc2N262T)、SEQIDNO:12(Ldc2K265N)、SEQIDNO:13(Ldc2S111C/N262T)、SEQIDNO:14(Ldc2S111C/K265N)、SEQIDNO:15(Ldc2N262T/K265N)和SEQIDNO:16(Ldc2S111C/N262T/K265N)的氨基酸序列。13.权利要求12的表达质粒载体，其中所述Ldc2的突变体是进一步包含选自以下的一个或多个突变的SEQIDNO:4的氨基酸序列：在氨基酸位置111处至X的突变，在氨基酸位置262处至X’的突变和在氨基酸位置265处至X”的突变；X、X’和X”独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；并且条件是X不是丝氨酸，X’不是天冬酰胺，而且X”不是赖氨酸。14.权利要求11-13中任一项的表达质粒载体，其中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。15.权利要求14的表达质粒载体，其中所述第七多核苷酸序列是为了在大肠杆菌细胞中的最佳多肽表达而经密码子优化的多核苷酸。16.权利要求14的表达质粒载体，其中所述骨架质粒是大肠杆菌表达质粒载体。17.权利要求16的表达质粒载体，其中所述骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101和它们的任何衍生质粒。18.权利要求17的表达质粒载体，其中所述表达质粒载体进一步包含启动子多核苷酸序列，所述启动子多核苷酸序列包含SEQIDNO:5的多核苷酸序列，其位于多核苷酸序列的上游。19.权利要求11-13中任一项的表达质粒载体，其中所述宿主细胞为蜂房哈夫尼菌细胞。20.包含整合入宿主细胞染色体的第七多核苷酸的第一突变宿主细胞，其中所述第七多核苷酸编码包含一个或多个第八多肽的一个或多个第七多肽，所述第八多肽选自SEQIDNO:4(Ldc2)的氨基酸序列、Ldc2的片段和Ldc2的突变体。21.权利要求20的第一突...

【专利技术属性】
技术研发人员：周豪宏，李乃强，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31