在可滴定氨基酸具有修饰的赖氨酸脱羧酶制造技术

本发明专利技术提供了与野生型赖氨酸脱羧酶相比，具有在碱性pH下增加活性的突变的CadA多肽。本发明专利技术还提供产生这种突变多肽的方法，经遗传修饰以过表达所述突变多肽的微生物，以及产生这种微生物的方法。

Modified lysine decarboxylase in titratable amino acids

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在可滴定氨基酸具有修饰的赖氨酸脱羧酶专利技术背景大多数酶由于其是两性分子而在较窄的pH范围内最佳地起作用。周围环境的pH直接影响构成酶的氨基酸的酸性和碱性基团上的电荷。这些电荷的变化影响酶的净电荷、活性位点的pKa及酶表面的电荷分布。结果，pH的变化会影响酶的活性、溶解性和稳定性。被称为酸脱羧酶的蛋白质类别是催化碱性氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸)的脱羧酶反应以产生多胺作为在许多微生物中酸应激反应的一部分的一组酶。大肠杆菌(Escherichiacoli)具有一些PLP依赖性酸脱羧酶：CadA，LdcC，AdiA，SpeA，SpeC，SpeF，GadA和GadB。所有这些酶在窄pH范围内起作用，且酶活性在该pH范围之外明显降低(Kanjeeetal.,Biochemistry50,9388-9398,2011)。先前已经观察到这些PLP依赖性脱羧酶二聚化形成完整活性位点。在某些情况下，如CadA，二聚体形成十聚体，聚集成为最佳功能所需的较高分子量蛋白质复合物。抑制较高分子量的蛋白质复合物形成(例如在最佳pH之外的条件下)导致功能的明显降低(Kanjeeetal.,TheEMBOJournal30,931-944,2011)。蛋白质中各个氨基酸的pKa值对于确定其生物分子功能是重要的，因为蛋白质-水溶液中的主要反应之一是某些氨基酸与蛋白质环境的质子交换。pKa是在中性和荷电状态之间自由能差异的量度，及表示氨基酸提供或接受质子的倾向。某些氨基酸具有可滴定基团，使其更容易接受和提供质子。这些氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。一些氨基酸的样品pKa值为：天冬氨酸为4.0，谷氨酸为4.4，半胱氨酸为8.7，酪氨酸为9.6，组氨酸为6.3，赖氨酸为10.4，精氨酸为13.0(NielsenJE&VriendG,Proteins43,403-412,2001)。根据文献资源不同，这些pKa值可以变化0.5。可滴定基团是否接受或提供质子取决于其环境，例如pH或其附近的其它氨基酸。例如，当pH小于可滴定基团的pKa时，该基团更可能接受质子。相反，当pH大于可滴定基团的pKa时，该基团更可能提供质子。当一组可滴定的氨基酸接受或提供质子时，取决于质子交换发生前的电荷，氨基酸可以带正电荷、负电荷或中性的。当两基团彼此接近时，带电基团可以与其它带电基团相互作用。相同电荷相互排斥，相反电荷相互吸引。质子化的中性电荷基团通过氢键相互作用仍可与其它基团相互作用。了解蛋白质可滴定基团的pKa值不仅对于理解pH如何影响多肽折叠和酶活性是重要的，而且对蛋白质-蛋白质相互作用也很重要(JensenJE,CurrPharmBiotechnol9,96-102,2008)，特别是在酸脱羧酶的情况下，其四级结构由于环境pH的变化而发生显著变化。酸脱羧酶对碱性pH的耐受性是重要的，因为其作为产物产生的多胺提高反应环境的pH。因此，酸脱羧酶的活性通常随着产生更多的多胺而降低，当反应环境的pH超过野生型酸脱羧酶所耐受的pH范围时，这可导致脱羧反应过早地停止。很少有研究评估具有可滴定基团的各种氨基酸突变对酸脱羧酶功能的影响。基于先前文献(Kanjee,etal.TheEMBOJournal30,931-944,2011)，当环境pH改变时，CadA从由十聚体和高级寡聚物组成的状态转变为主要由二聚体组成的状态。十聚体的形成是形成高级寡聚物的先决条件。已经表明，CadA在pH5.0-5.5条件下最佳地起作用(LemonnierM&LaneD,Microbiology144,751-760,1998)。在这种酸性pH，Kanjee等使用EM表明CadA主要以高级寡聚物存在。当pH增加到6.0以上或当存在抑制剂ppGpp时，不形成高级寡聚物，且脱羧酶功能显著降低。然而，还没有关于描述CadA高级寡聚物如何形成以及在其形成中起作用的氨基酸残基的文献。专利技术概述本专利技术部分基于突变的发现，所述突变提供稳定四元结构形成所需的化学相互作用的能力，以及增加的稳定性以允许突变蛋白在更宽的pH范围起作用。在更宽的pH范围起作用的能力对于保持高反应速率而不需要添加额外的化学物以维持pH值是重要的。在宽pH范围维持高反应速率可以使赖氨酸更快地转变为尸胺及减少所需的设备量。蛋白质对碱性pH的耐受性不再需要添加额外的化学物以维持pH值的需要。用于维持pH的这些化学物通常形成盐，例如(SO42-或Cl-)，其进入废水中或必须使用另外的纯化步骤从生产过程中除去。因此，在比野生型更宽的pH范围内起作用的突变酸脱羧酶通过减少在该过程中形成的盐的量而降低整个过程的成本和环境中留下的痕迹。氨基酸组氨酸的pKa为6.3，这是酸脱羧酶蛋白CadA在不同寡聚状态之间转换的pH。寡聚状态的改变也改变了蛋白质的活性。CadA蛋白中至少一个组氨酸残基看起来在检测环境pH中起重要作用。pH与CadA功能之间的联系与作为酸应激反应系统一部分的CadA蛋白的功能一致。当环境的pH足够高时，不再需要CadA蛋白继续合成将进一步提高环境pH的多胺。当环境的pH降至低于组氨酸残基的pKa时，组氨酸残基可以经历可滴定基团的质子化状态的变化，导致CadA蛋白从较高的寡聚状态转变为较低的寡聚状态，从而影响CadA蛋白的活性。来自大肠杆菌的CadA蛋白(SEQIDNO：2)中总共有24个组氨酸残基，其中2个位于N-末端翼结构域(wingdomain)(H9和H23)，1个位于接头区(H152))，11个位于PLP结合亚结构域(H193，H197，H245，H250，H282，H300，H328，H366，H379，H396，H402)，4个位于亚结构域4(H458，H474，H483，H521)及6个位于C-末端结构域(H594，H599，H600，H629，H685，H694)。来自埃希氏菌属(Escherichia)的CadA蛋白序列与来自克雷伯氏菌属(Klebsiella)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的序列比对，表明所有24个组氨酸残基除了一个残基(H521)之外都是保守的(图1)。来自肠道沙门氏菌的CadA等价蛋白在氨基酸位置521具有精氨酸残基。一方面，本专利技术因此提供了CadA变体多肽，其在相应于参照SEQIDNO：2确定的氨基酸455-483的区域中包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代选自位置457和/或458；及其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2-5任一个具有至少70％的相同性。在一些实施方案中，所述CadA变体多肽在位置457和458包含取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是H458A/C/E/F/G/M/P/T/V/W/Y或者D457A/C/E/F/H/I/K/L/M/N/S/W/Y。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是H458A/C/F/M/V/W/Y或者D457A/C/H/K/L/M/N/S。在一些实施方案中，所述CadA变体多肽进一步在参照SEQIDNO：2确定的位置460包含天冬氨酸取代。在一些实施方案中，所述天冬氨酸取代是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CadA变体多肽，其在相应于参照SEQ ID NO：2确定的氨基酸455至483的区域中包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代在位置458的组氨酸残基或者在位置457的天冬氨酸残基；及其中所述CadA变体多肽与SEQ ID NO：2‑5任一个具有至少70％的相同性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.CadA变体多肽，其在相应于参照SEQIDNO：2确定的氨基酸455至483的区域中包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代在位置458的组氨酸残基或者在位置457的天冬氨酸残基；及其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2-5任一个具有至少70％的相同性。2.权利要求1的CadA变体多肽，其中所述至少一个氨基酸取代在位置458的组氨酸残基。3.权利要求2的CadA变体多肽，其中组氨酸取代是H458A/C/E/F/G/M/P/T/V/W/Y。4.权利要求2的CadA变体多肽，其中组氨酸取代是H458A/C/F/M/V/W/Y。5.权利要求1的CadA变体多肽，其中所述至少一个氨基酸取代在位置457的天冬氨酸。6.权利要求5的CadA变体多肽，其中天冬氨酸取代是D457A/C/E/F/H/I/K/L/M/N/S/W/Y。7.权利要求5的CadA变体多肽，其中天冬氨酸取代是D457A/C/H/K/L/M/N/S。8.权利要求1的CadA变体多肽，其包含在位置457的天冬氨酸残基和在位置458的组氨酸残基的氨基酸取代。9.权利要求1-8任一项的CadA变体多肽，其中所述变体多肽进一步包含在参照SEQIDNO：2确定的位置460的天冬氨酸的取代。10.权利要求9的变体多肽，其中天冬氨酸取代是D460C/F/Q/I/S/V/W/Y。11.权利要求9的CadA变体多肽，其中所述氨基酸取代是D460C/F/Q/I/S/V/W。12.权利要求9的CadA变体多肽，其中所述氨基酸取代是D460F/V/W/Y。13.权利要求1-12任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少70％的相同性。14.权利要求1-12任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的相同性。15.权利要求1-12任一项的CadA变体的肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少70％的相同性。16.权利要求1-12任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的相同性。17.遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求1-12任一项的CadA变体多肽。18.权利要求17的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少70％的相同性。19.权利要求17的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的相同性。20.权利要求17的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或者SEQIDNO：5具有至少70％的相同性。21.权利要求17的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或者SEQIDNO：5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的相同性。22.权利要求17-21任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞被遗传修饰以过表达一或多种赖氨酸生物合成多肽。23.权利要求17-22任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。24.权利要求23的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或者棒杆菌属(Corynebacterium)。25.权利要求23的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)。26.权利要求23的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。27.权利要求23的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)。28.一种产生尸胺的方法，所述方法包括将权利要求18-27任一项的遗传修饰的宿主细胞在表达所述CadA变体多肽的条件下进行培养。29.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1-12任一项的CadA变体多肽的核酸序列。30.权利要求29的多核苷酸，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少70％的相同性。31.权利要求29的多核苷酸，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的相同性。32.权利要求29的多核苷酸，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少70％的相同性。33.权利要求29的多核苷酸，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或者SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：周豪宏，陈玲，陆文强，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：上海,31