修饰的赖氨酸脱羧酶制造技术

本发明专利技术提供了与野生型赖氨酸脱羧酶相比，具有在碱性pH增加活性的突变的CadA多肽。本发明专利技术还提供了产生这种突变体多肽的方法、经过基因修饰以过表达这种突变体多肽的微生物，以及产生这种微生物的方法。

Modified lysine decarboxylase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的赖氨酸脱羧酶
技术介绍
大多数酶在窄pH范围内发挥最佳功能，因为它们是两性分子。周围环境的pH直接影响组成酶的氨基酸的酸性和碱性基团上的电荷。这些电荷的变化影响酶的净电荷，活性位点的pKa和酶表面的电荷分布。因此，pH的变化会影响酶的活性、溶解度和稳定性。被称为酸脱羧酶的一类蛋白质是一组酶，该酶催化碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸)的脱羧酶反应，以生成在许多微生物中作为酸应激反应一部分的多胺。大肠杆菌(Escherichiacoli)有几种PLP依赖性酸脱羧酶：CadA、LdcC、AdiA、SpeA、SpeC、SpeF、GadA和GadB。所有这些酶均在窄pH范围内发挥作用，超出该pH范围，酶活性显著降低(Kanjee等人,Biochemistry50,9388-9398,2011)。之前已经观察到，这些PLP依赖性脱羧酶发生二聚化，以形成完整的活性位点。在一些情况下，如CadA，二聚体形成十聚体，该十聚体聚集成最佳功能所需的较高分子量蛋白复合物。抑制较高分子量蛋白复合物的形成(例如，在最佳pH值以外的条件下)导致功能显著下降(Kanjee等人,TheEMBOJournal30,931-944,2011)。蛋白质中各个氨基酸的pKa值对确定其生物分子功能是重要的，因为蛋白质-水溶液中的一个主要反应是某些氨基酸与蛋白质的环境交换质子。pKa是中性态和带电态之间自由能差异的量度，并表示氨基酸提供或接受质子的倾向性。某些氨基酸具有可滴定基团，使其更易于接受和提供质子。这些氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。一些氨基酸的示例性的pKa值为：天冬氨酸为4.0、谷氨酸为4.4、半胱氨酸为8.7、酪氨酸为9.6、组氨酸为6.3、赖氨酸为10.4和精氨酸为13.0(NielsenJE&amp；VriendG，Proteins43，403-412，2001)。根据文献来源，这些pKa值可能相差0.5。可滴定基团接受还是提供质子将取决于其环境，如pH值或其附近的其他氨基酸。例如，当pH值小于可滴定基团的pKa时，基团将更可能接受质子。与之相反，当pH值大于可滴定基团的pKa时，基团将更可能提供质子。当氨基酸的可滴定基团接受或提供质子时，依赖于质子交换发生前其开始具有的电荷，氨基酸可以变成带正电荷、带负电荷或中性的。当两个基团彼此靠近时，带电基团可以与其他带电基团相互作用。相似的电荷相互排斥，相反的电荷相互吸引。质子化的中性带电基团仍然可以通过氢键相互作用与其他基团相互作用。对蛋白质可滴定基团的pKa值的理解不仅对理解pH如何影响多肽折叠和酶活性，而且对蛋白质-蛋白质相互作用是重要的(JensenJE，CurrPharmBiotechnol9，96-102，2008)，特别是在酸脱羧酶的四级结构因环境pH变化而发生显著变化的情况下。目前，在评价带有可滴定基团的各种氨基酸的突变对酸脱羧酶功能的影响方面的研究甚少。基于先前文献(Kanjee等人,EMBOJournal30,931-944,2011)，当环境pH改变时，CadA从由十聚体和高阶寡聚物组成的状态转变为主要由二聚体组成的状态。十聚体的形成是形成高阶寡聚物的先决条件。已经表明，在pH5.0-5.5，CadA的功能最佳(LemonnierM&LaneD，Microbiology144，751-760，1998)。在此酸性pH，Kanjee等人使用EM分析表明CadA主要以高阶寡聚物存在。当pH升高到6.0以上或存在抑制剂ppGpp时，不形成高阶寡聚物，脱羧酶功能显著降低。然而，缺乏描述CadA高阶寡聚物如何形成以及在其形成中发挥作用的氨基酸残基的文献。
技术实现思路
本专利技术部分基于突变的发现，该突变提供了稳定四级结构形成所需的化学相互作用的能力，并增加了稳定性，以允许突变型酸脱羧酶蛋白在更宽的pH范围内发挥作用。在较宽的pH范围内发挥作用的能力对于维持高反应速率而不需要添加额外的化学物质来维持pH值非常重要。在宽pH范围内维持高反应速率将使赖氨酸更快地转化为尸胺并减少所需设施的数量。该蛋白质对碱性pH的耐受性消除了添加额外化学物质以维持pH值的需要。这些用于维持pH值的化学物质通常形成盐(例如SO42-或Cl-)，该盐进入废水或必须使用额外的纯化步骤从工艺中去除。因此，与野生型相比，在更宽的pH范围内发挥作用的突变型酸脱羧酶将通过减少工艺过程中形成的盐量来降低整个工艺的成本和环境中留下的痕迹。因此，在一个方面，本专利技术提供了一种CadA变体多肽，该CadA变体多肽在相应于参照SEQIDNO:2确定的氨基酸276至509的区域中的谷氨酸残基处包括至少一个氨基酸取代，其中该谷氨酸残基出现在蛋白质的表面，具有朝向外部环境的侧链，位于缺少确定的二级结构的蛋白质区段中；以及其中该CadA变体多肽与SEQIDNO：2至5的任一个具有至少70％的相同性。在一些实施方案中，所述取代在谷氨酸残基，该谷氨酸残基的位置选自参照SEQIDNO:2确定的位置291、344、355、463、482和499。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为E291A/C/D/H/R/V/G/K/N/S、E355C/F/H/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y或E482C/F/I/L/S/W/Y/A/H/K/M。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为E291A/C/D/H/R/V、E355C/F/H/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y或E482C/F/I/L/S/W/Y。在一些实施方案中，CadA变体多肽包括在选自位置291、344、355、463、482和499中的至少两个位置处谷氨酸残基的取代。在一些实施方案中，CadA变体多肽包括在选自位置291、344、355、463、482和499中的至少三个位置处谷氨酸残基的取代。在一些实施方案中，CadA变体多肽包括在选自位置291、344、355、463、482和499中的四个或五个位置或所有六个位置处谷氨酸残基的取代。在一些实施方案中，本段中所述的CadA变体多肽与SEQIDNO:2具有至少70％的相同性。在一些实施方案中，所述CadA变体多肽与所述SEQIDNO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。在一些实施方案中，CadA变体多肽与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5具有至少70％的相同性。在一些实施方案中，所述CadA变体多肽与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。在另一方面，本专利技术提供了一种遗传修饰的宿主细胞，该宿主细胞包括本文所述的CadA变体多肽，例如在前段所述的。在典型的实施方案中，所述遗传修饰的宿主细胞被遗传修饰以过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒杆菌属(Corynebacteria)。在一些实施方案中，所述遗传修饰的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CadA变体多肽，其在相应于参考SEQ ID NO：2确定的氨基酸276‑509的区域中的谷氨酸残基包含至少一个氨基酸取代，其中所述谷氨酸残基位于蛋白表面，侧链朝向外部环境，位于所述蛋白缺少确定的二级结构的区段中，并且其中所述CadA变体多肽与SEQ ID NO：2‑5任一个具有至少70％的相同性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种CadA变体多肽，其在相应于参考SEQIDNO：2确定的氨基酸276-509的区域中的谷氨酸残基包含至少一个氨基酸取代，其中所述谷氨酸残基位于蛋白表面，侧链朝向外部环境，位于所述蛋白缺少确定的二级结构的区段中，并且其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2-5任一个具有至少70％的相同性。2.权利要求1的CadA变体多肽，其中所述取代位于选自位置291、344、355、463、482和499的位置处的谷氨酸残基。3.权利要求2的CadA变体多肽，其包含位于选自位置291、344、355、463、482和499的至少两个位置处的谷氨酸残基的取代。4.权利要求2的CadA变体多肽，其中所述氨基酸取代是E291A/C/D/H/R/V/G/K/N/S，E355C/F/H/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y或E482C/F/I/L/S/W/Y/A/H/K/M。5.权利要求4的CadA变体多肽，其中所述氨基酸取代是E291A/C/D/H/R/V，E355C/F/H/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y或E482C/F/I/L/S/W/Y。6.权利要求1-5任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少70％的相同性。7.权利要求1-5任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。8.权利要求1-5任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少70％的相同性。9.权利要求1-5任一项的CadA变体多肽，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。10.一种遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求1-5任一项的CadA变体多肽。11.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少70％的相同性。12.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。13.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少70％的相同性。14.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CadA变体多肽与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。15.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞被遗传修饰以过表达一或多种赖氨酸生物合成多肽。16.权利要求10-15任一项的遗传修...

【专利技术属性】
技术研发人员：周豪宏，陆文强，陈玲，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：上海,31