修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途制造技术

本文提供了促胰液素的修饰形式或突变形式以及包含其的组合物。特别地，促胰液素的修饰形式或突变形式允许分析物通过修饰的或突变的促胰液素纳米孔有效捕获和/或易位。还提供了使用未修饰的促胰液素或修饰的或突变形式的促胰液素的方法和组合物，例如用于表征分析物如靶多核苷酸。

Modified nanopores, compositions containing them and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途
本文提供了促胰液素的修饰形式或突变形式以及包含其的组合物。还提供了使用修饰或突变形式的促胰液素和组合物的方法，例如，用于表征靶分析物，例如靶多核苷酸。本文还提供了包含促胰液素和在促胰液素内腔中提供的酶的组合物。
技术介绍
跨膜孔(例如纳米孔)已用于鉴定小分子或折叠的蛋白质并监测单分子水平的化学或酶促反应。跨过重构到人工膜中的纳米孔的DNA电泳易位对于诸如DNA测序和生物标记物识别的实际应用具有很大的前景。然而，双链或单链DNA通过具有面向带负电荷的氨基酸的内表面的纳米孔的易位是无效的。
技术实现思路
本公开一般涉及使用促胰液素作为纳米孔的分析物检测。本公开一般涉及修饰的纳米孔。在一些实施方案中，本公开内容提供了修饰的促胰液素纳米孔和亚基多肽、包含其的组合物或装置及其用途。在一些实施方案中，本文提供的经修饰的促胰液素纳米孔可用于分析物检测和分析，因为它们促进跨纳米孔的分析物(例如，带负电或疏水的生物聚合物，例如多核苷酸或蛋白质)的有效捕获和/或易位。因此，如本文所述的促胰液素纳米孔，例如经修饰的促胰液素纳米孔可用于表征分析物，例如靶多核苷酸或多肽，以及其他合适的应用。因此，在进一步的实施方案中，本文描述了用于表征分析物(例如，靶多核苷酸或多肽)的方法和组合物。本公开的一个方面的特征在于修饰的促胰液素纳米孔，例如，设置在膜中。经修饰的促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定内腔，所述内腔在顺式开口和反式开口之间延伸穿过膜，其中所述腔表面包含一个或多个氨基酸修饰。氨基酸修饰的实例包括但不限于改变电荷的修饰(例如，带有带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸)，改变其疏水性的氨基酸修饰(例如，疏水性氨基酸取代中性氨基酸)，改变促胰液素中开口大小(例如收缩或门)的氨基酸修饰(例如取代一个或多个比天然存在的氨基酸具有较小或较大侧基的氨基酸，或限制开口的一个或多个氨基酸的缺失)，抑制或阻止门打开的氨基酸修饰(例如用更刚性的氨基酸取代一个或多个柔性氨基酸)，及其组合。修饰的促胰液素纳米孔的顺式打开和反式打开可以具有适合应用(例如，检测和/或分析诸如靶多核苷酸的分析物)需要的任何大小的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的顺式开口可具有60埃至120埃的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的反式打开可具有40埃至100埃的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的收缩可具有约7.5埃至约25埃的直径。任何类型的促胰液素可用于产生本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔。例如，在一些实施方案中，促胰液素可以是II型分泌系统(例如但不限于GspD)。在一些实施方案中，促胰液素可以是III型分泌系统(例如但不限于YscC和InvG)。在一些实施方案中，促胰液素可以是IV型分泌系统(例如但不限于PilQ)。在其中促胰液素是InvG的一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可以进一步包含亚基多肽，其具有与SEQIDNO：1中所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，腔表面可以进一步限定腔内的收缩，该收缩在SEQIDNO：1的氨基酸D28、E225、R226和/或E231处具有一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)。这种氨基酸修饰的实例包括但不限于(i)D28N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E225；(v)缺失R226；和(vi)E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔，腔表面可包含在氨基酸E41、Q45或E114处具有一个或多个氨基酸修饰的捕获部分，其实例包括但不限于(i)Q45R/K；(ii)E41N/Q/T/S/G/R/K；和(iii)E114N/Q/T/S/G/R/K。修饰的促胰液素纳米孔可以是同源多聚体(例如，纳米孔内的所有亚基是相同的)或异源多聚体(例如，至少一个亚基与纳米孔内的其他亚基不同)。修饰的促胰液素纳米孔可包含任何数量的亚基多肽，其足以形成足够大的腔以允许靶分析物(例如，多核苷酸)通过。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含9-20个亚基多肽，其中至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或直至所有)所述亚基多肽包含一种或多种如本文所述的氨基酸修饰。因此，本文还提供了修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和包含编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的核苷酸序列的多核苷酸。例如，在一个方面，修饰的GspD促胰液素纳米孔包含亚基多肽，其包含具有与SEQIDNO：36所示的促胰液素结构域的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域。来自霍乱弧菌和来自大肠杆菌ETEC的GspD的促胰液素结构域含有帽门。其他II型分泌系统促胰液素亚基多肽，包括一些GspD亚基多肽，例如大肠杆菌K12，不包含帽门。在一个方面，修饰的促胰液素纳米孔可以是不包含帽门的纳米孔。在SEQIDNO：36中所述的促胰液素结构域包含位置56和77之间的帽门。例如，可以修饰SEQIDNO：36中所示的促胰液素结构域以删除全部或部分帽门，例如可以删除或替代SEQIDNO：36的D55或T56至T77的全部或部分氨基酸。或者，修饰的GspD促胰液素纳米孔可以自然地缺少帽门。SEQIDNO：36的D55或T56至T77的氨基酸对应于SEQIDNO：32的D371或T372至T393的氨基酸。可以修饰GspD的中央门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。在SEQIDNO：36中设置的促胰液素结构域包含位置144至157之间的中央门，其对应于SEQIDNO：32的位置460和473。修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQIDNO：36所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y63至R71可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F156可以被A取代，D153可以被S取代，和/或N151和N152可以各自独立地被G或S取代。SEQIDNO：36的D55、T56、K60、Y63、D64、R71、E73、T77、K78、G137、N151、N152、D153、F156和G165对应于SEQIDNO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。修饰的促胰液素GspD纳米孔可以在一个方面包含亚基多肽，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种置于膜中的修饰的促胰液素纳米孔，所述修饰的促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定内腔，所述内腔在顺式开口和反式开口之间延伸穿过所述膜，其中所述腔表面包含一种或多种氨基酸修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.10 US 62/457,4831.一种置于膜中的修饰的促胰液素纳米孔，所述修饰的促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定内腔，所述内腔在顺式开口和反式开口之间延伸穿过所述膜，其中所述腔表面包含一种或多种氨基酸修饰。2.根据权利要求1所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述一种或多种氨基酸修饰包含改变电荷的修饰。3.根据权利要求2所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述电荷改变的修饰是用带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。4.根据权利要求1或2所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括用疏水氨基酸取代中性氨基酸。5.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述顺式开口的直径范围为60埃至120埃。6.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述反式开口的直径范围为40埃到100埃。7.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素纳米孔包含直径为约7.5埃至约25埃的收缩部分。8.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是II型分泌系统。9.根据权利要求8所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是GspD。10.根据权利要求9所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽包含具有与SEQIDNO：36所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域。11.根据权利要求9或10所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽具有与SEQIDNO：34或35所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。12.根据权利要求9至11中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述GspD不包括帽门。13.根据权利要求9至12中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中修饰GspD的中央门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用带中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。14.根据权利要求13所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽包含具有与SEQIDNO：36所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。15.根据权利要求14所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中Y63至R71缺失和/或被GSG或SGS取代，F156被A取代，D153被S取代，和/或N151和N152各自独立地被G或S取代。16.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是IV型分泌系统。17.根据权利要求16所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是PilQ。18.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是III型分泌系统。19.根据权利要求18所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是YscC。20.根据权利要求18所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是InvG。21.根据权利要求20所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽具有与SEQIDNO：1中所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列。22.根据权利要求20或21所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述腔表面进一步限定所述腔内的收缩部，所述收缩部在SEQIDNO：1的氨基酸D28、E225、R226和/或E231处具有一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)。23.根据权利要求22所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述收缩部的一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)包括以下一个或多个：i.D28N/Q/T/S/G/R/K；ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；iv.缺失E225；v.缺失R226；和vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。24.根据权利要求20至22中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述腔表面包含在氨基酸E41、Q45或E114处具有一个或多个氨基酸修饰的捕获部分。25.根据权利要求24所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述捕获部分包含一个或多个下列氨基酸修饰：i.Q45R/K；ii.E41N/Q/T/S/G/R/K；和iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。26.一种修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列，其中所述修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQIDNO：1的D28、E41、E114、Q45、E225、R226和E231的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)。27.根据权利要求26所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)包括以下一种或多种：i.D28N/Q/T/S/G/R/K；ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；iv.缺失E225；v.缺失R226；和vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。28.根据权利要求26或27所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含一个或多个以下氨基酸修饰：i.Q45R/K；ii.E41N/Q/T/S/G/R/K；和iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。29.一种修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的WTInvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列，其中所述修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQIDNO：2的D199、E212、E285、Q216、E396、R397和E402的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)和/或在SEQIDNO：2的位置170和171或171和172之间插入内肽酶切割位点。30.根据权利要求29所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)包括以下一种或多种：i.D199N/Q/T/S/G/R/K；ii.E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；iii.R397N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；iv.缺失E396；...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉科马·贾亚辛格，伊丽莎白·杰恩·华莱士，普拉提克·拉吉·辛格，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB