具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法技术

本发明专利技术公开了具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术公开的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，将其谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与参考序列比对，其具有如下突变中的一种或两种的组合：(1)谷氨酰胺合成酶突变体对应于参考序列的第59位氨基酸位点突变为X1；其中，X1＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、P、T、V或Y；(2)谷氨酰胺合成酶突变体对应于参考序列的第296位氨基酸位点突变为X2；X2＝A、D、E、G、I、K、M、P、Q、R、S、T、或V。该谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，该谷氨酰胺合成酶突变体可以用于培育草铵膦抗性的植物新品种。

Glutamine synthase mutants with glutamic acid Phosphine Resistance and their application and cultivation methods

【技术实现步骤摘要】
具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法。
技术介绍
草铵膦(glufosinate，glufosinateammonium，商品名称Basta)是由安万特公司(现为拜耳公司)开发的谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，其有效成分为phosphinothricin(简称PPT)，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。该产品于1986年上市，销售额逐年上升。草铵膦的靶标酶是GS，在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamylphosphate。但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从而GS的活性受到抑制。PPT能抑制GS所有已知的形式。草铵膦抑制GS的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵的过量积累，叶绿体解体，从而光合作用受抑制，最终导致植物死亡。目前培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株Streptomyceshygroscopicus的bar基因和菌株S.viridochromogenes的pat基因。Bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。抗草铵膦品种具有极大的使用价值，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。但是由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度仍然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。特别是bar基因和pat基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，更容易造成消费者的抵触心理。Bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触GS之前，该酶很难使草铵膦完全失活，因为很多GS分布在细胞膜上，因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。在植物中过量表达野生型GS可以降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其耐性程度不足以商业化应用。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法，该谷氨酰胺合成酶突变体可以赋予植株草铵膦抗性，在农作物应用该谷氨酰胺合成酶突变体，植物可以正常的生长和发育。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，将上述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与参考序列比对，上述谷氨酰胺合成酶突变体具有如下突变中的一种或两种的组合：(1)上述谷氨酰胺合成酶突变体对应于上述参考序列的第59位氨基酸位点突变为X1；其中，X1＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、P、T、V或Y；(2)上述谷氨酰胺合成酶突变体对应于上述参考序列的第296位氨基酸位点突变为；X2＝A、D、E、G、I、K、M、P、Q、R、S、T、或V；优选地，上述参考序列为来源于第一植物的野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列，上述第一植物为水稻。本专利技术的研究发现，将任意一种植物来源的目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位或/和第296位作如上突变后(即单独地以第59位或第296位，或者同时将第59位和第296位作如上突变)，得到的谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，同时该谷氨酰胺合成酶可以保持其自身正常的生物酶催化活性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植株可以在草铵膦存在的条件下正常生长。因此，该谷氨酰胺合成酶突变体可以用于培育草铵膦抗性的植物新品种，只要使植物体内表达该谷氨酰胺合成酶突变体即可产生草铵膦抗性。本专利技术所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体可以通过如下方法得到：将任意一种植物来源的目标野生型谷氨酰胺合成酶与来源水稻的野生型谷氨酰胺合成酶进行序列比对，在目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位或/和第296位进行突变，例如将目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶的第59位氨基酸残基突变为A、C、D、E、F、G、H、I、K、P、T、V或Y，或/和是将第296位氨基酸残基突变为A、D、E、G、I、K、M、P、Q、R、S、T或V，即得到本专利技术所述的谷氨酰胺合成酶突变体；上述参考序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1为来源水稻的野生型谷氨酰胺合成酶。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述谷氨酰胺合成酶突变体来源于第二植物，所述第二植物为水稻、大豆、小麦、大麦、黍稷、向日葵、花生、燕麦、萝卜、绿豆、胡萝卜、蚕豆、甘薯、马铃薯、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、甜瓜、番茄、茄子、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、豌豆、大葱、花椰菜、芥蓝、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、辣椒、茼蒿、黄花菜、棉花、扁豆、油菜、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、绿豆、苦瓜、玉米、高粱、谷子、荞麦、丝瓜、菜瓜、西瓜、苜蓿、牧草、草坪草、茶、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草、甜菜或甘蔗。需要说明的是，所述谷氨酰胺合成酶突变体对应的野生型谷氨酰胺合成酶来源于第二植物，所述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于所述参考序列的第59位和第296位之外的其他氨基酸位点上不具有完全消除第59位和第296位提供的草铵膦抗性的突变。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，上述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于上述参考序列的第59位和第296位之外的其他位点上不具有使其草铵膦抗性低于来源上述第二植物的野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性的突变，而是具有增强其草铵膦抗性的突变。需要说明的是，在本专利技术揭示了上述突变具有草铵膦抗性加强的基础上，本领域技术人员容易想到在除第59和296位点之外的其他位点上进行再次突变，以获得草铵膦抗性不低于相同来源的野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性的二次突变体，无论这些二次突变体是通过何种方式(例如可以是在野生型谷氨酰胺合成酶的基础上在第59位和第296位之外的其他位点中的一个或多个位点进行突变)突变得到的，只要其具有上述突变中的任意一者，且其草铵膦抗性不低于野生型谷氨酰胺合成酶的草铵膦抗性，这次二次突变体也是属于本专利技术的保护范围。基于本专利技术所揭示的内容，本领域技术人员只需要将来源于任意植物的目标野生型谷氨酰胺合成酶与SEQIDNO.1所示的水稻野生型谷氨酰胺合成酶进行序列比对，将目标野生型谷氨酰胺合成酶对应于SEQIDNO.1的第59位或/和第296位的氨基酸残基进行突变，即可得到具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。需要说明的是，如果目标野生型谷氨酰胺合成酶与SEQIDNO.1相比较，在除59位和296位之外的其他位点上还具有不同的氨基酸残基差异时，这种情形下，保留目标野生型谷氨酰胺合成酶初始的氨基酸序列。也就是说，本专利技术所述的野生型谷氨酰胺合成酶突变体不要求其除59位和296位之外的其他位点的氨基酸残基类别与SEQIDNO.1完全一致，可以是完全一致或部分一致，在特殊情况下，可以是完全不一致。需要说明的是，本专利技术所涉及的蛋白序列比对所使用的比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，将所述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与参考序列比对，所述谷氨酰胺合成酶突变体具有如下突变中的一种或两种的组合：(1)所述谷氨酰胺合成酶突变体对应于所述参考序列的第59位氨基酸位点突变为X1；其中，X1＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、P、T、V或Y；(2)所述谷氨酰胺合成酶突变体对应于所述参考序列的第296位氨基酸位点突变为X2；X2＝A、D、E、G、I、K、M、P、Q、R、S、T或V；优选地，所述参考序列为来源于第一植物的野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列，所述第一植物为水稻；所述参考序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，将所述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基酸序列与参考序列比对，所述谷氨酰胺合成酶突变体具有如下突变中的一种或两种的组合：(1)所述谷氨酰胺合成酶突变体对应于所述参考序列的第59位氨基酸位点突变为X1；其中，X1＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、P、T、V或Y；(2)所述谷氨酰胺合成酶突变体对应于所述参考序列的第296位氨基酸位点突变为X2；X2＝A、D、E、G、I、K、M、P、Q、R、S、T或V；优选地，所述参考序列为来源于第一植物的野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列，所述第一植物为水稻；所述参考序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶突变体来源于第二植物，所述第二植物为水稻、大豆、小麦、大麦、黍稷、向日葵、花生、燕麦、萝卜、绿豆、胡萝卜、蚕豆、甘薯、马铃薯、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、甜瓜、番茄、茄子、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、豌豆、大葱、花椰菜、芥蓝、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、辣椒、茼蒿、黄花菜、棉花、扁豆、油菜、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、绿豆、苦瓜、玉米、高粱、谷子、荞麦、丝瓜、菜瓜、西瓜、苜蓿、牧草、草坪草、茶、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草、甜菜或甘蔗。3.根据权利要求1或2所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于所述参考序列的第59位具有突变S59X1或者第296位具有突变H296X2，所述谷氨酰胺合成酶突变体的长度和其余位点的氨基酸残基与SEQIDNO.1相同；或者，所述谷氨酰胺合成酶突变体在对应于所述参考序列的第59位具有突变S59G以及第296位具有突变H296R，所述谷氨酰胺合成酶突变体的长度和其余位点的氨基酸残基与SEQIDNO.1-3中的任意一者相同；优选地，所述谷氨酰胺合成酶突变体的氨基序列选自如下序列中的任意一种：(1)由SEQIDNO.2在其第59位由S突变为G和第296位由H突变为R得到；(2)由SEQIDNO.3在其第59位由S突变为G和第296位由H突变为R得到。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体；优选地，所述核酸分子的碱基序列由SEQIDNO.4-6中任意一者通过如下碱基突变得到：(1)由SEQIDNO.4作如下任意一种突变得到：(a):第175-176位由AG变为GC；(b):第175位由A变为T；(c):第175-177位由AGC变为GAT；(d):第175-177位由AGC变为GAG；(e):第175-176位由AG变为TT；(f):第175位由A变为G；(g):第175-176位由AG变为CA；(h):第176位由G变为T；(i):第176位由G变为A；(j):第175-...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓龙群，张震，卢远根，付颖钊，唐宜，向汝华，冯小容，胥南飞，
申请(专利权)人：四川天豫兴禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51