硒代酪氨酸翻译系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种氨酰基‑tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基‑tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其具有相同酶活性的保守性变体或同源物。本发明专利技术还提供一种硒代酪氨酸翻译系统，其包含：(i)硒代酪氨酸；(ii)所述正交氨酰基‑tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基‑tRNA合成酶用硒代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。本发明专利技术还提供利用上述硒代酪氨酸翻译系统设计改造蛋白酶的方法，以及该方法编码产生的蛋白酶。

Selenotyrosine Translation System and Its Application

【技术实现步骤摘要】
硒代酪氨酸翻译系统及其应用
本专利技术属于生物化学领域。具体地，本专利技术提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，其中所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本专利技术还涉及一种硒代酪氨酸(简写为SeHF)翻译系统及其应用。具体而言，本专利技术涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将硒代酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的硒代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入硒代酪氨酸的方法。本专利技术还涉及一种用这套翻译系统和这种方法设计改造目标蛋白酶的方法，以及该方法产生的含有硒代酪氨酸的突变蛋白酶，例如，插入硒代酪氨酸的放射形土壤杆菌磷酸三酯酶(简写为arPTE)突变体，以及插入硒代酪氨酸的放射形土壤杆菌磷酸三酯酶突变体的应用。
技术介绍
酪氨酸在许多酶催化剂中普遍存在，它的作用包括：1、底物直接亲核攻击(如DNA拓扑异构酶等)；2、去质子化过程中的广义碱(如糖苷水解酶等)；3、离去基团的广义酸质子化(如酪氨酸苯酚裂解酶等)；4、活性部位的氢键供体/受体或电排斥(如酮类固醇异构酶等)；5、阳离子-π相互作用(如萜类环化酶等)；6、参与氧化还原和电子转移反应(如核糖核苷酸还原酶、FtmOx1等)；7、直接金属配位(如过氧化氢酶、半乳糖氧化酶等)。为了探讨酪氨酸残基在酶催化作用中的机理并更好地设计改造酶，我们将酶活性位点上的酪氨酸突变为带有金属或者邻位取代的非天然氨基酸(简写为UAA)。但是，由于空间位阻，在酶活性位点引入外来原子可能会显著损害其酶活性，因此，我们需要采取一种最小化降低酶活性损伤的策略，即对酶活性位点的氨基酸采取单原子置换。硒与氧的主族相同，硒的范德华半径为1.9埃，而氧的半径为1.52埃。我们选择合成并遗传插入2-氨基-3-(4-氢硒苯基)丙酸(简称硒代酪氨酸或SeHF)，它与酪氨酸相比有一个侧链上单个氧-硒原子取代，因此可以提供一种有价值的机制工具来研究酪氨酸在酶催化剂中的作用。同时，与苯酚(pKa＝10)相比，苯基烯醇侧链的pKa(pKa＝5.9)显著降低，苯基硒酸盐阴离子的亲核性增强，这也为更好地设计催化酶提供了良好机会。此外，硒可用于通过多波长反常散射定相法来测定蛋白质结构。受含有硒代半胱氨酸的天然或设计酶启发，硒代酪氨酸也可用于设计具有过氧化物酶和脱卤素酶活性的人造酶。磷酸三酯酶(简写为PTE)是具有多种底物的双金属蛋白，底物之一的对氧磷是一种最常用的杀虫剂。使用金属活化的水作为亲核试剂，PTE可以通过简单的一步SN2置换反应裂解甲基对氧磷(简写为DNP)的P-O键，生成磷酸二甲酯(DMP)和对硝基苯酚(PNP)，而不涉及任何共价的酶-底物中间体，使其成为理想的酶设计模型。此外，更好地了解和改进PTE催化活性对保护环境也具有一定的重要性。细菌PTEs的结构和机制已被广泛报道，其转换率由若干组分确定：米氏配合物(ES)结合系数(k1)和解离系数(k2)，P-O键断裂系数(k3)和产物释放系数(k5)。据报道，P-O键断裂k3步骤不是限速步骤，而产物释放k5则是催化循环中最慢和限制速率的步骤。PTEs的底物结合袋，同时也是产物释放袋，由许多疏水性残基组成，包括Tyr309、Phe132和Trp131，对氧磷底物的芳环被以上这些氨基酸的侧链包围，PTEs的转化率被认为是已经接近它们的自然进化极限。众多的PTEs突变体通过实验室定向进化或合理设计分离出来，以提高对各种底物的催化效率。然而，野生型和突变型PTEs的最适pH值通常大于8.5，这可能限制了其在环境修复、农药解毒和临床应用中的应用。我们推测，带负电的SeHF可以促进产物释放，并且SeHF侧链的pKa值(pH5.9)可以显著改善PTE在中性pH环境下的催化活性。因此本研究旨在通过遗传密码扩展，用非天然氨基酸——SeHF替代酪氨酸，从而显著提高PTE的酶活性。同时，本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selectorcodon)，从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO2002/086075，其专利技术名称为“METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASEPAIRS”；WO2002/085923，其专利技术名称为“INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS”；WO2004/094593，其专利技术名称为“EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE”。定点特异性捅入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，AngewandteChemieInt.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.OpinioninChemicalBiology9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。
技术实现思路
I、技术方案本专利技术人经过筛选，首次获得一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示氨基酸、SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体和与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列具有一定的序列同源性的同源物组成的组，其中所述保守性变体和同源物具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性，其中所述序列同源性可以为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，甚至更优选95％以上，甚至更优选99％以上。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用硒代酪氨酸(简写为SeHF)优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入SeHF。这是本专利技术人首次发现的，相应地，在本专利技术中将其命名为正交硒代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(简写为SeHFRS)。在一个优选的实施方案中，所述正交硒代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。在上述发现的基础上，本专利技术提供一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种正交氨酰基‑tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体和与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的同源物组成的组，其中所述保守性变体或同源物具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示氨基酸序列、SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体和与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的同源物组成的组，其中所述保守性变体或同源物具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。2.一种硒代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：(i)硒代酪氨酸；(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述硒代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。3.根据权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述选择密码子是琥珀密码子，并且所述翻译系统还包含编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。4.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。6.一种产生在至少一个所选位置定点特异性插入硒代酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供权利要求2所述的硒代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：(i)硒代酪氨酸；(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，安晓景，王天元，韩明杰，黄爱萍，陈超，江欢欢，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11