一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种定点突变的黑曲霉6‑4光修复酶及其构建方法，所述的光修复酶具有有SEQ ID NO:1，所示的核苷酸序列。本发明专利技术从现有的WT黑曲霉中获得6‑4光修复酶基因基因序列，进行人工密码子优化之后，设计突变引物得到突变的基因片段，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌在20℃和1mM IPTG条件下获得了较好的表达。相比于WT光修复酶，本发明专利技术表达出的突变体酶S460N的活性更高，而且活性保持更加持久稳定，能更好的修复紫外线造成的DNA损伤，更有利于作为化妆品类，医药类产品的添加成分应用于人们的生活。

A site-directed mutant Aspergillus niger 6-4 photorepair enzyme and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法
：本专利技术属于生物工程
，涉及基因、蛋白质工程
，具体涉及一种黑曲霉DNA光修复酶基因及其构建方法。
技术介绍
：随着科学技术的发展，人类破坏自然的活动加剧，造成大气中臭氧层稀薄甚至产生空洞，阻挡紫外线的能力减弱。于是到达地球表面的中波紫外线(UVB，280nm-315nm)剂量逐渐增强，导致人类各种皮肤损伤的发病几率大大增加。其原理是UVB能直接被皮肤细胞DNA吸收，引起DNA上两个相邻的胸腺嘧啶产生稳定共价结合的二聚体，包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物(6-4photoproduct)，这两类二聚体破坏DNA正常结构，从而抑制DNA的复制与转录，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌。光修复酶是一类在细菌、真菌、植物和动物中都普遍存在，在修复紫外线造成的DNA损伤中发挥重要作用的酶。自然条件下CPD与6-4光产物这两类光致损伤分别占损伤总量的80-90％和10-20％，分别由CPD光修复酶和6-4光修复酶进行修复。光修复酶通常是一类单体蛋白，以非共价的形式结合了1到2种具有发色团的辅酶，其中一种是FAD，为最常见的黄素辅酶形式。与自然界中利用NADH或是亚铁血红素类似，FAD作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子。FAD主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，SQ)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，HQ)。在光修复酶中，必须依赖双电子还原态FAD辅酶执行功能。CPD光修复酶和6-4光修复酶两者具有高度同源的氨基酸序列和极其相似的结构，并且反应机制也大致相同。含有底物的DNA双链靠近光修复酶，双链打开，损伤的DNA会深入到光修复酶的底物结合口袋，形成一种酶-底物的复合物。在光照条件下，光修复酶中完全还原型状态(hydroquinone，HQ)的FAD通过直接吸收光子的能量，或是通过第二辅酶传递到HQ，形成激发态HQ，接着HQ激发态上的电子传递到DNA损伤底物上，使得二聚体的底物断裂成正常的胸腺嘧啶，DNA结构恢复。最后，额外的电子会传递到中性自由基状态的FADH●，还原为FADH-，整个修复过程极其短暂。尽管两类光修复酶同源性较高，但是两类光修复酶作用底物十分专一，只能修复特定的底物，而不能互换。自1999年德国科学家报道光修复酶修复受损人类臀部皮肤的研究后，将光修复酶作为化妆品的添加成分，逐渐成为防晒产品的主流。以往研究人员对CPD光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。
技术实现思路
：根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的第1个技术问题是提供了一种黑曲霉6-4光修复酶基因。本专利技术所要解决的第2个技术问题提供是含有该基因的表达载体。本专利技术所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。本专利技术所要解决的第4个技术问题是所述光修复酶的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因，该6-4光修复酶具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO.2的氨基酸序列。一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因的pET-22b(+)重组质粒。一种宿主，所述的宿主为定点突变的黑曲霉6-4光修复酶重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。该工程菌表达黑曲霉6-4光修复酶蛋白的条件为0.5mM-1mM的IPTG诱导浓度及20℃的诱导温度。本专利技术的构建方法为从现有的野生型(wild-type,WT)黑曲霉(Aspergillusniger)中获得6-4光修复酶基因基因序列，进行人工密码子优化之后，设计突变引物得到突变体的基因S460N，其编码如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-S460N；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-S460N；在20℃和1mMIPTG条件下获得了较好的表达。所述的黑曲霉6-4光修复酶生物医药、化妆品领域的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术采用定点突变(site-specificmutagenesis或site-directedmutagenesis)的方法改造蛋白：通过在目的DNA片段(质粒，基因组)中某些目标位点引入特定的变化(包括碱基的添加，删除，点突变)，通过聚合酶链式反应(PCR)方法将某个目的基因的特定碱基突变(碱基缺失或者插入)，从而改变翻译出来的氨基酸序列，以及随之折叠成的蛋白质的空间结构和发挥的功能。本专利技术通过体外表达黑曲霉6-4光修复酶，进行功能和应用性研究，为体外修复和治疗紫外线造成的皮肤损伤提供方向。比较CPD光产物和6-4光产物可知，6-4光产物比CPD光产物更具有致突变性，它能直接引起细胞的凋亡，而CPD光产物仅仅造成细胞周期暂时或短期的停滞现象，因此，对6-4光修复酶的研究就具有重要的意义。相比于野生型黑曲霉6-4光修复酶，本专利技术表达出的S460N突变体酶活力提高，而且活性保持更加持久稳定。附图说明:图1为实施例1中PCR扩增的S460N突变体基因泳道1-2为S460N的突变体基因。图2为实施例1所制的S460N突变体酶纯化的SDS-PAGE电泳图泳道1-3为纯化蛋白分管收集样品，M为低分子量标准蛋白。图3为WT光修复酶活性检测示意图WT：检测的是第0min、7min、15min、25min、40min、90min的底物变化过程。图4为实施例1所制的S460N突变体酶活性检测示意图S460N：检测的是第0min、4min、10min、15min、25min、90min的底物变化过程图5为实施例1所制的S460N突变体酶及WT光修复酶酶活性曲线S460N：检测的是第0min、30s、1min、2min、4min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min的底物325nm吸收峰变化曲线。WT：检测的是第0min、30s、1min、2min、4min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min的底物325nm吸收峰变化曲线。图6为实施例1所制的S460N突变体酶及WT光修复酶酶活性曲线S460N：检测的是第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。WT：检测的是第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。具体实施方式:下面结合实施例对本专利技术作详细的说明。实施例1：突变体酶S460N基因的获得以及表达载体的构建1、获得WT黑曲霉光修复酶基因查找Genbank(GeneBankaccessionXP_001397458.2)的黑曲霉光修复酶(WT)基因序列，基于大肠杆菌(Escherichiaco本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定点突变的黑曲霉6‑4光修复酶，其特征在于：其含有SEQ ID NO:1，所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶，其特征在于：其含有SEQIDNO:1，所示的核苷酸序列。2.一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶，其特征在于：其含有SEQIDNO:2的氨基酸序列。3.一种载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的核苷酸序列。4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2所述的氨基酸序列。5.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3所述的载体。6.权利要求1所述的一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶的构建方法，包括以下步骤：从现有的WT黑曲霉(Aspergillusniger)中获得6-4光修复酶基因基因序列，进行人工密码子优化，设计突变引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国萍，文斌，王胜地，徐蕾，王鹏，黄士平，曹正宇，汪源，卞命杰，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34