在蜂房哈夫尼菌中稳定的重组表达质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术所公开的内容涉及到一个稳定的重组表达质粒载体，包括一段编码重组型抗毒素基因的聚核苷酸，其表达一种多肽，来中和对宿主细胞有毒的多肽，该有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达；一段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，该稳定的重组表达质粒载体由在蜂房哈夫尼菌中可复制骨架质粒衍生而成。本发明专利技术所公开的内容还包括带有上述稳定的重组表达质粒的转化子，和利用该转化子制造生物基戊二胺的方法，以及按本发明专利技术所述方法制备的生物基戊二胺。本发明专利技术公开的内容还包括用上述方法制造的生物基戊二胺为原料制造的聚酰胺及含有该物质的组合物。本发明专利技术公开的内容也包括制备五亚甲基-1,5-异氰酸酯的方法，包括用本发明专利技术中的方法制备生物基戊二胺，再将生物基戊二胺转化为五亚甲基-1,5-异氰酸酯。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于分子生物学领域，具体涉及ー种稳定的重组表达质粒载体及其用途。
技术介绍
戊ニ胺是ー种可用于生产多种化学品的平台化合物。自20世纪80年代以来，用生物法生产戊ニ胺的研究领域获得了广泛关注。在生物法中，戊ニ胺可以通过赖氨酸脱羧生成。目前，用生物法生产戊ニ胺主要采用以下两种方法微生物发酵生产或生物体外酶催化生产。在发酵生产赖氨酸的方法中，将赖氨酸脱羧酶基因加到赖氨酸生产菌株(如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌)中，将生物合成赖氨酸的途径进一歩延伸为合成戊ニ胺的途径。然而，已报告的戊ニ胺产率低于使用相同的不含赖氨酸脱羧酶基因的菌种生产赖氨酸的产 率。产率低可能是由于戊ニ胺对生产菌株的毒性抑制作用。此外，可以对细菌进行改造或利用诱导来表达赖氨酸脱羧酶，用于催化生物体外的赖氨酸脱羧反应。ー种方法是在未经改造的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei, H. alvei)菌株中对染色体编码的赖氨酸脱羧酶基因进行诱导表达。然而，此种方法所报道的酶产量低。另ー种方法涉及重组细菌的构建。例如，日本一些公司(JP2009028045，US7189543，CN102056889)相继报道能够过量表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌重组菌的构建，并利用全细胞或者细胞裂解液催化赖氨酸脱羧得到戊ニ胺。然而，大量表达对宿主细胞有毒的蛋白质使得表达质粒在几次传代后不稳定。必须在发酵液中使用抗生素以确保在培养过程中重组质粒的稳定。抗生素的使用可能导致对抗生素有抗药性的细菌的发展，也会在环境中保持高水平的抗药性微生物。例如，见Martinez, "Environmental pol lutionbyantibiotics and by antioiotic resistance determinants, Environmenta丄Pollution(2009), Vol. 157，Issue 11,2893 - 2902。由于对抗生素有抗药性的细菌对健康和生态环境的危害，抗生素的使用是不环保的。因此，我们需要ー个更有效的重组质粒载体，能够在没有抗生素筛选的条件下，多次连续传代仍然保持稳定。
技术实现思路
详细说明下面描述中的具体细节仅仅是为了能够充分理解本专利技术的实施例。但是作为本领域的技术人员应该知道本专利技术的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本专利技术实施例的要点。在本专利技术中所使用的氨基酸，多肽，碱基序列，核酸的縮写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，发表在European Journal ofBiochemistry 1984年第138卷第9期的“准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导”(美国专利和商标局)一文中的縮写，以及在生物
中通用的縮写。在本公开中所讨论的“核苷酸序列”，“聚核苷酸”或“DNA分子”，可能包括双链DNA(即，由正义链和反义链组成的双链DNA)或单链DNA，及其片段。在此“其片段”是指该核苷酸序列的一部分，其编码的多肽与该核苷酸序列的完整序列所编码的多肽的功能基本相同。例如，一种编码抗毒素基因的核苷酸表达可以中和毒素多肽的多肽。编码抗毒素基因的核苷酸的一个片段所表达的多肽也能中和该毒素多肽，因此与编码抗毒素基因的核苷酸的全序列所表达的多肽相比提供了大致相同的功能。同样，编码毒素基因的核苷酸的ー个片段所表达的多肽与编码毒素基因的核苷酸的全序列所表达的多肽对与细胞有基本相同的毒性。这里提到的核苷酸序列，聚核苷酸或DNA分子不仅限于功能区，可能包括至少ー个表达调控区，编码区，前导序列，外显子，内含子和表达盒(见，例如Papadakis etal., Promoters and Control Elements DesigningExpression Cassettes for GeneTherapy, "Current Gene Therapy (2004)，4，89-113)。此外，核苷酸序列或聚核苷酸的例子 可能指RNA或DNA。具有特定的氨基酸序列的多肽和具有特定的DNA序列的聚核苷酸可能包括该序列的片段、同源序列、衍生序列和突变序列。核苷酸序列或聚核苷酸的突变体(如突变DNA)的例子，包括自然发生的突变、人工突变，和/或删除，替换，添加和/或插入等突变。这种突变体所编码的多肽应该理解为与未突变的原核苷酸序列编码的多肽实质上具有相同的功能。本专利技术所公开的内容包括一个稳定的重组表达质粒载体，包括以下部分—段编码抗毒素基因的聚核苷酸，其表达ー种多肽，来中和ー种对宿主细胞有毒的多肽，与之对应的有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达，—段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，该稳定的重组表达质粒载体由在宿主细胞中可复制骨架质粒衍生而成。在一些实施例中，该毒素基因在宿主细胞的染色体基因组中编码。在一些实施例中，该稳定的重组表达质粒载体进ー步包括编码毒素基因的聚核苷酸。在一些实施例中，该编码毒素基因的聚核苷酸和/或编码抗毒素基因的聚核苷酸是重组的。在一些实施例中，毒素基因，抗毒素基因和编码多肽表达产物的聚核苷酸中的一个或多个基因被进ー步用密码子优化技术进行优化，以在宿主细胞中对相应多肽提供更好的表达。例如，优化毒素基因可以包括DNA序列的优化，以与序列SEQ ID NO 1或SEQ ID 3相比更好地表达多肽毒素。在某些实施例中，抗毒素基因包括进ー步优化的DNA序列，以与序列SEQ ID NO :2或SEQ ID :4相比更好地表达抗毒素多肽。在某些实施例中，多肽表达产物的基因包括进ー步优化的DNA序列，以与序列SEQ IDNO :5或SEQ ID :6相比更好地表达多肽表达产物。密码子优化是一种技术，其通过增加感兴趣的基因在宿主细胞内的翻译效率来得到最大限度的蛋白表达。一个物种的DNA核苷酸序列被优化成为另ー个物种的DNA核苷酸序列。DNA序列被分成三个ー组(密码子)。一种氨基酸的低频率密码子被宿主细胞中相同氨基酸的高频率密码子所取代。由此，优化的DNA序列在宿主细胞中的表达得到改善。例如见 http: //www. Ruptalab. orR/shubhR/pdf/shubhra codon, pdf,关于密码子优化技术介绍，在此作为參考全部納入。这里使用的毒素/抗毒素基因对有两个基因，其中ー个是毒素基因，表达对宿主细胞有毒性的多肽，另ー个是抗毒素基因，表达的多肽能够中和该毒素多肽对宿主细胞的毒性。某些原核生物含有ー个或多个染色体编码的毒素基因。某些原核生物含有编码特定毒素/抗毒素基因对的内源性质粒。(见，Wertz et al. “Chimeric nature of twoplasmids of Hainia alvei encoding the bacteriocins alveicms A and B.，’Journa丄of Bacteriology.，(2004) 186 :1598-1605.)毒素/抗毒素基因对通常在维持遗传信息的稳定和应激反应中发挥作用。当细胞中有染色体或质粒编码的抗毒素基因吋，抗毒素蛋白能够持续表达，中和毒素蛋白，維持细胞的存活。在某些原核生物中，抗毒素蛋白的降解速度比毒素蛋白快。如果带有抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定的重组表达质粒载体，包含：一段编码重组型抗毒素基因的聚核苷酸，其表达一种多肽，来中和对宿主细胞有毒的多肽，该有毒的多肽由一段编码毒素基因的聚核苷酸在宿主细胞中表达；一段编码多肽表达产物的聚核苷酸，其中，该稳定的重组表达质粒载体由在蜂房哈夫尼菌中可复制骨架质粒衍生而成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：庞振华，李乃强，刘驰，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，上海凯赛生物科技有限公司，山东凯赛生物科技材料有限公司，山东凯赛生物技术有限公司，吉林凯赛生物技术有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：