一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术的谷氨酸脱羧酶重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。本发明专利技术还提供了该重组质粒的构建方法以及其应用。本发明专利技术的重组质粒，大大提高了重组谷氨酸脱羧酶的表达量，促进谷氨酸的脱羧，由此进一步实现了提高γ-氨基丁酸的产量，也缩短了生产周期，更适于大规模工业化生产，并且安全性较高，避免了因安全性问题对产品应用领域的限制，在食品及医药领域均可应用。

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是一种以自由态形式存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质。GABA具有多种生理功能，如降血压、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、镇静安神、促进激素分泌和保肝利肾等功效，因此，受到了人们的广泛关注。目前，国内外对GABA进行制备，主要采用化学合成法或微生物发酵法。由于采用化学合成法制备GABA时，需从产品中脱除的有毒成分复杂且产品的安全性差，因此，相较于化学合成法，微生物发酵法具有更为良好的发展前景。微生物发酵法制备GABA，主要是利用谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD；EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸脱羧，从而生成GABA的。目前，已经发现的能够积累GABA的微生物主要有大肠杆菌和乳酸菌，其中，乳酸菌为益生菌，所以在生产GABA时乳酸菌更为常用。但是，GAD是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的限速酶，微生物积累GABA速度较慢，因此，导致GABA的产量较低，难以大规模工业化生产。为提高GABA的产量，出现了利用微生物的基因工程酶法合成技术，通过过量表达菌株中的高活性谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量。在此研究中，采用的方法主要是将来源于可积累GABA的菌株中的谷氨酸脱羧酶基因导入到具有活性较低的内源谷氨酸脱羧酶编码基因的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力。上述方法虽在一定程度上提高了GABA的产量，但是，在利用上述宿主菌进行GABA的生产过程中，均需在发酵时添加L-谷氨酸或L-谷氨酸盐作为前体物质，使之脱羧为GABA，加之有些宿主菌的安全性仍受到人们的质疑，在一定程度上制约了GABA产品的应用。因此，近些年来又出现了把乳酸菌或大肠杆菌来源的GAD基因导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，利用重组谷氨酸棒杆菌生产GABA的研究。重组谷氨酸棒状菌可在发酵过程中积累产生谷氨酸，与此同时表达GAD基因合成GAD，对积累的谷氨酸进行脱羧，可实现无需添加底物L-谷氨酸及L-谷氨酸盐即可一步合成GABA，同时，谷氨酸棒杆菌为食品微生物，安全性较高，可应用于食品及医药领域。然而，目前的重组谷氨酸棒状菌表达GAD催化转化的产量仍维持在较低水平，究其原因，主要是将原菌体中的GAD基因导入宿主菌时，采用的穿梭表达载体的启动子强度差，导致重组谷氨酸脱羧酶表达量少、活性低，进而导致GABA收率不高，并且，即使分批添加足够的底物(谷氨酸)，在重组谷氨酸脱羧酶表达量少、活性低的情况下，也无法获得较多的产物。因此，目前亟待寻求一种新的方法从根本上解决采用重组谷氨酸棒状菌生产GABA产量较低的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是现有技术中的重组谷氨酸脱羧酶在宿主菌谷氨酸棒状菌中表达量少、活性低的问题，进而提供一种可实现GAD的高效表达的谷氨酸脱羧酶重组质粒以及该重组质粒的构建方法。本专利技术要解决的第二个技术问题是现有技术中的重组谷氨酸棒状菌生产GABA产量较低的问题，提供一种采用重组谷氨酸棒状菌高效生产GABA的方法。本专利技术的谷氨酸脱羧酶重组质粒，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB；所述麦芽糖启动子pamyE具有SEQIDNo.1所示的序列结构。所述麦芽糖启动子的基因序列为，SEQIDNo.1：CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTCCTACGATCAAAAATCCTCCCTGCTTCCCTCAACTGTTTTTATATGTATTTGTATGTTTTAGGCCCGATTACTTGTGAATATGTGGAATACCTCACTAAGGTGGAAGGAAGGCTAACCAGTTCATAGTCGGACTGCAATCCGCTATGAAGTACTTGGTGGCGCTGGGAAGAAGCCTTCGTTATGGGAGGTCTCCCAGACACAATCGAATACGGGCCGGATATCCATCTCGGCTCATCACCCCGCTTTTTATCAAGAAAGATGAGGACCTC。所述穿梭表达载体pEKEx2为大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体。所述谷氨酸脱羧酶基因gadB的序列结构见NCBI中GeneID为12931794的序列。构建上述谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，包括以下步骤：(1)取穿梭表达载体pEKEx2，根据其多克隆位点及Ptac启动子的序列，将pEKEx2载体用PvuII限制性内切酶单切，改造获得不含Ptac启动子的pEKEx2载体；(2)取谷氨酸脱羧酶的全长基因序列gadB与谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，利用Overlap-PCR技术进行拼接得到pamyE-gadB基因；(3)将拼接后的pamyE-gadB基因插入到步骤1)中得到的不含Ptac启动子的穿梭表达载体pEKEx2中，构建得到谷氨酸脱羧酶重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。进一步的，所述步骤(2)具体为：根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下四条引物：YW3:5’-GAACCCGGGATCCGAGCTCCCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3’SmaIYW4:5’-CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3’YW5:5’-ATGGATAAGAAGCAAGTAACG-3’YW6:5’-GGACCCGGGTACCGTCGACTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3’SmaI分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组和E.coliK-12基因组DNA做为模板，YW3、YW4的pamyEPCR产物和YW5、YW6的gadBPCR产物回收后进行overlap-PCR扩增。进一步的，所述步骤(3)具体为：取步骤(2)的PCR产物pamyE-gadB进行SmaI单酶切，并与步骤(1)中改造后的pEKEx2载体进行PvuII单酶切，回收酶切产物进行连接，得到重组表达质粒pEKEx2-pamyE-gadB。包含有上述谷氨酸脱羧酶重组质粒的重组菌，所述重组菌为生产谷氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌。构建所述的重组菌的方法，包括将所述的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB，导入所述谷氨酸棒状菌ATCC13032的感受态细胞中的步骤，以使所述重组质粒高效表达，构建得到所述重组菌。所述重组菌在发酵制备γ-氨基丁酸领域中的应用。所述重组菌发酵生产γ-氨基丁酸的方法，包括将权利要求7所述的重组菌进行扩大培养以诱导其大量表达谷氨酸脱羧酶的步骤，以及以谷氨酸为底物，在适宜条件下进行发酵产γ-氨基丁酸的步骤。所述重组菌的扩大培养步骤中，还包括向发酵液中加入麦芽糖和/或IPTG作为诱导剂的步骤。所述重组菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷氨酸脱羧酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2‑pamyE‑gadB；所述麦芽糖启动子pamyE具有SEQ ID No.1所示的序列结构。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB；所述麦芽糖启动子pamyE的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种构建权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取穿梭表达载体pEKEx2，根据其多克隆位点及Ptac启动子的序列，将pEKEx2载体用PvuII限制性内切酶单切，改造获得不含Ptac启动子的pEKEx2载体；(2)取谷氨酸脱羧酶的全长基因序列gadB与谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，利用Overlap-PCR技术进行拼接得到pamyE-gadB基因；(3)将拼接后的pamyE-gadB基因插入到步骤1)中得到的不含Ptac启动子的穿梭表达载体pEKEx2中，构建得到谷氨酸脱羧酶重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。3.根据权利要求2所述的构建权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下四条引物：YW3:5'-GAACCCGGGATCCGAGCTCCCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3'SmaIYW4:5'-CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3'YW5:5'-ATGGATAAGAAGCAAGTAACG-3'YW6:5'-GGACCCGGGTACCGTCGACTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3'SmaI分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组和E.coliK-12基因组DNA做为模板，YW3、YW4...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷志敏，王期，赵娇娇，温尧林，
申请(专利权)人：苏州凯祥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32