本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统包括食品级宿主干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936和食品级表面展示载体pQJ5；同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，即采用融合基因取代载体上的基因，转入宿主中并检测其在宿主细胞表面的表达情况。本发明专利技术的食品级表面展示系统，同时具备食品级的宿主和食品级的载体，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，因其不含抗生素抗性筛选标记，故不存在潜在的生物可转移性危害。同时通过构建的宿主和载体，配合融合基因，实现了异源蛋白的表达。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统包括食品级宿主干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936和食品级表面展示载体pQJ5；同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，即采用融合基因取代载体上的基因，转入宿主中并检测其在宿主细胞表面的表达情况。本专利技术的食品级表面展示系统，同时具备食品级的宿主和食品级的载体，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，因其不含抗生素抗性筛选标记，故不存在潜在的生物可转移性危害。同时通过构建的宿主和载体，配合融合基因，实现了异源蛋白的表达。【专利说明】一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。
技术介绍
据估算，地球上每年有大约1500万人死于传染性疾病，大约占到总死亡人数5700万的25%。疫苗接种是人类对抗细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病的有效手段，一直是人们关注和研究的热点之一。基因工程载体疫苗，指利用非致病微生物作为载体，将病菌的保护性抗原基因片段重组到载体微生物中，用表达保护性抗原的微生物作为疫苗。痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒等是常用的病毒载体，沙门氏菌和卡介苗则是常用的细菌载体。这些疫苗载体的共同特点是，它们多为致病菌的减毒苗，可能存在潜在的危害性。如能利用非致病菌尤其是益生菌作为疫苗载体，将大大提高疫苗的安全性。乳杆菌(Lactobacilli)是乳酸菌中最大的一个属，长期以来一直被应用于食品发酵和保存中(酸奶中含有多种乳杆菌)，被公认为“安全级”(generally recognized assafe,GRAS)微生物，因此用乳杆菌作为载体传递抗原进行免疫有着诱人的前景。这些菌株经过分子遗传修饰，带有目的病原的抗原成分，口服或注射后，可以产生特异的局部或全身免疫反应。而乳杆菌自身的一些特点，如:在肠道吸附定植的能力；对胃酸、胆汁的耐受性；产生抗菌物质的特性等，更使其成为基因工程载体疫苗的最佳选择。干酪乳杆菌是一种在食品和医疗领域具有重要应用前景的食品级微生物。近年来，干酪乳杆菌的基因克隆和 表达系统引起了人们的广泛关注，其中很重要的一个研究方向就是利用干酪乳杆菌表达系统进行基因工程疫苗的构建。国内外利用干酪乳杆菌构建了能引起机体免疫应答的多株基因工程疫苗，但大多利用抗生素标记基因如氯霉素抗性基因和红霉素抗性基因作为整个系统的筛选标记，这些标记基因的生物可转移性可能危害人类健康，从而限制了这一类干酪乳杆菌基因工程疫苗在食品和医药等工业的应用。要想构建完全食品级的基因工程疫苗，必需同时具备食品级的宿主和食品级的载体，而且宿主和载体必需具有可以完成互补筛选的食品级标记。目前，这方面的研究主要集中在乳酸乳球菌上，对于干酪乳杆菌的研究较少。经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号200910192146.X，公告日2010-02-24，公开了一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N，该乳酸菌食品级表达载体以天然食品防腐剂乳链菌肽Nisin抗性基因nisi作为选择标记。中国专利文献号CN200410093875.7，授权公告日2007_11_21，公开了一种乳酸乳球菌的食品级载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。中国专利文献号CN200610154649.4，授权公告日2010-09-08，公开了两种乳酸乳球菌食品级载体PNIl和pNI2，这两个载体分别利用乳酸链球菌素(Nisin)免疫基因和抗性基因为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。中国专利文献号CN200710175269.3，授权公告日2010-09-08，公开了一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述已有技术存在的不足，提供一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统并利用该系统实现异源蛋白的成功表达，本系统中所有DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。本专利技术的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，特殊之处在于包括食品级宿主干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) Q-5和食品级表面展示载体pQJ5。所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 7936。所述食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936是对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) ATCC 334进行质粒消除并筛选而获得，丧失了代谢乳糖的能力。所述质粒消除是包括亚致死高温诱导的质粒消除或新霉素诱导的质粒消除。所述食品级表面展示载体pQJ5，其碱基序列如序列表所示。 所述食品级表面展示载体pQJ5是通过如下方案获得: 在乳酸菌表达载体PNZ2102的基础上保留来源于乳酸链球菌的pSH71复制子和PlacA启动子，敲除编码氯霉素抗性基因的碱基序列，插入来源于干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因IacEUacG和lacF，插入来自于嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因slpA及其启动子和信号肽。所述干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因IacEUacG和IacF是食品级表面展示载体PQJ5与食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936完成互补筛选的食品级标记。所述嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因slpA及其启动子和信号肽序列是用于实现异源蛋白在细胞表面表达的DNA兀件。本专利技术同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，通过如下方案实现: 采用重组PCR方法构建报告基因绿色荧光蛋白基因gfp和S-层蛋白基因slpA的融合基因slpA-gfp，并用该融合基因取代载体pQJ5上的slpA，采用电转化法将构建好的载体PQJ5质粒转入干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936中，运用激光共聚焦显微镜法检测绿色荧光蛋白在干酪乳杆菌细胞表面的表达。本专利技术一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，同时具备食品级的宿主和食品级的载体，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，因其不含抗生素抗性筛选标记，故不存在潜在的生物可转移性危害。同时通过构建的宿主和载体，配合融合基因，实现了异源蛋白的表达。【专利附图】【附图说明】食品级宿主干酪乳杆菌Q-5于2013年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC 7936。图1:本专利技术的食品级宿主菌株干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936与出发菌株干酪乳杆菌ATCC 334代谢乳糖能力的比较结果； 图2:本专利技术的食品级表面展示载体pQJ5的构建流程图； 图3:利用本专利技术的食品级表面展示系统表达绿色荧光蛋白的效果图4和0是携带重组质粒pQJ5_gfp的干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936 ；B是携带携带pQJ5的干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936 ；C 为干酪本文档来自技高网...
【技术保护点】
一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于包括食品级宿主干酪乳杆菌Q?5?CGMCC7936和食品级表面展示载体pQJ5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦加阳，王秀文，许平，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：
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