本发明专利技术公开了一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学或代谢工程领域。本发明专利技术将编码丙二酸转运酶的基因matB、丙二酸吸收途径的基因matC、酪氨酸脱氨酶(TAL)的基因、4-香桂酸：辅酶A连接酶(4CL)基因、查尔酮合成酶(CHS)基因、查尔酮异构酶(CHI)基因，共计六个基因组成的合成途径引入大肠杆菌BL21，从而获得了一株能以酪氨酸为底物合成柚皮素的重组菌，并通过模块化改造理论优化合成途径，最终菌株在摇瓶中以酪氨酸为底物发酵72h后，柚皮素的产量达到90mg/L。本发明专利技术采用的策略为今后微生物法生产天然小分子物质提供了一定的借鉴意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于合成生物学或代谢工程领域。本专利技术将编码丙二酸转运酶的基因matB、丙二酸吸收途径的基因matC、酪氨酸脱氨酶(TAL)的基因、4-香桂酸：辅酶A连接酶(4CL)基因、查尔酮合成酶(CHS)基因、查尔酮异构酶(CHI)基因，共计六个基因组成的合成途径引入大肠杆菌BL21，从而获得了一株能以酪氨酸为底物合成柚皮素的重组菌，并通过模块化改造理论优化合成途径，最终菌株在摇瓶中以酪氨酸为底物发酵72h后，柚皮素的产量达到90mg/L。本专利技术采用的策略为今后微生物法生产天然小分子物质提供了一定的借鉴意义。【专利说明】
本专利技术涉及，属于合成生物学或代谢工程领域。
技术介绍
黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2_苯基色原酮结构的化合物，其羟基衍生物多具黄色，因而得名。黄酮类化合物具有多种生物活性，主要包括心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎等，对镇痛、保肝、抗突变、降血糖和止咳平喘等具有预防、治疗或辅助治疗效果，而且人体不能合成黄酮类化合物，只能从植物性食物中获得，因此近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30%以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。黄酮类化合物分布广泛，种类繁多，黄酮类化合物主要包括黄酮类(如黄岑素、黄岑苷等)、黄酮醇类(如槲皮素、生松素等)、二氢黄酮类(如陈皮素、甘草苷等)、二氢黄酮醇类(如水飞蓟素、异水飞蓟素等)、异黄酮类(如大豆素、葛根素等)、二氢异黄酮类(如鱼藤酮等)、查尔酮类(如异甘草素、补骨脂乙素等)、橙酮类(如金鱼草素等)、黄烷类(如儿茶素等)、花色素类(如飞燕草素、矢车菊素等)和双黄酮类(如银杏素、异银杏素等)。而其中柚皮素是一种很重要的黄酮骨架物质，通过对柚皮素进行羟基化、还原化、烷基化、氧化等修饰可以获得八千多种其他黄酮类物质，另外柚皮素本身作为一种黄酮物质具有多种生物活性，主要包括缓解神经痛，防止脑水肿的发生，减少脑缺血的发生几率等。目前，工业上生产柚皮素主要采用植物提取的方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度柚皮素仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及柚皮素的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产柚皮素的研究都是在以香豆酸为底物，然而香豆酸价格昂贵，并且溶解度较低，难以存在于一般的培养基中；另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这些都抑制了微生物法在大规模工业化生产中的应用。本专利技术成是以较廉价的酪氨酸为底物，并通过模块化改造策略优化菌株使其在单一培养基中取得较高的柚皮素产量，为大规模工业化生产奠定了一定的基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供，是在Escherichia coli(BL21)中共表达3个质粒:pCDF-RgTAL_Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI 和 pACYCD-matB-matC。所述pCDF-RgTAL_Pc4CL是携带了编码酪氨酸脱氨酶TAL和4_香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因的P⑶FDuet-1。所述pET-PhCHS-MsCHI是携带了编码查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI的基因的pETDuet-Ι。所述pACY⑶-matB_matC是携带了编码丙二酸转运基因matB、丙二酸吸收酶的基因matC的pACYCDuet-1。pCDF-RgTAL_Pc4CL采用启动子Trc，拷贝数为20 ；pET-PhCHS-MsCHI采用启动子T7，拷贝数为40 ;pACYCD-matB-matC采用启动子T7，质粒拷贝数为10。编码所述丙二酸转运的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码所述丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，编码所述酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，编码所述4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，编码所述查尔酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，编码所述查尔酮异构酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。构建含有所述合成途径的Escherichia coli (BL21)重组菌的方案主要包括以下内容:(I)采用全基因合成方法获得途径所需要的六个基因；(2)通过酶切连接构建得到三个共表达质粒P⑶F-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB_matC，测序验证后，将三个共表达质粒以化学法转化Escherichia coli (BL21)感受态细胞；(3)挑选能在含有100ug/mL的氨苄，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等四种抗生素的LB平板上生长的菌落，使其在含上述的四种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR验证六个途径基因已成功转入到Escherichiacoli(BL21)中。利用含有所述合成途径的E`scherichia coli (BL21)重组菌发酵生产柚皮素的方法:(I)MOPS培养基(g/L):葡萄糖5，氯化铵4，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化铵5.1，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素(ATCC BAA-2326的配方)10ml，自来水定容；M0PS培养基的灭菌温度为115-121 °C，15min，维生素等热敏性材料配制后0.22 μ m膜过滤除菌，接种前加入。(2)将构建得到的基因工程菌株接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12_20h至菌株OD6tltl达到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基及终浓度ImM的IPTG，30 0C，250rpm条件下培养60h。本专利技术的有益效果:本专利技术是以一株Escherichia coli (BL21)为出发菌株,利用合成生物学和代谢工程手段在菌株体内构建了一条从酪氨酸到柚皮素的由TAL、4CL、CHS、CH1、matB、matC等六个基因构成的合成途径，将总途径分成了三个模块，通过微调模块的代谢通量，使代谢流最大程度的流向终产物。重组菌Escherichia coli(BL21)在直接以酪氨酸为底物，发酵72h后，柚皮素的产量达到90mg/L，无需添加贵重的前体物质，只在单一培养基中便能合成柚皮素，成功实现了以酪氨酸为底物来合成柚皮素。其中采用的模块化改造策略为今后微生物法生产其他天然小分子化合物提供了一定的借鉴意义。【专利附图】【附图说明】图1模块化改造优化柚皮素产量。图2LC-MS分析重组工程菌产生的柚皮素；A1，发酵液中产物的LC/ES1-MS图谱；A2，发酵液中产物的MS/MS图谱；B1，标准品的LC/ES1-MS图谱；B2，标准品的MS/MS图谱。【具体实施方式】柚皮素浓度的测定:高本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌，其特征在于，是在Escherichia?coli(BL21)中表达了柚皮素合成途径需要的关键酶系：酪氨酸脱氨酶TAL、4?香桂酸：辅酶A连接酶4CL、查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI、丙二酸转运酶matC以及丙二酸吸收酶matB。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，周景文，吴俊俊，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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