本发明专利技术涉及一种免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，尤其涉及乳制品以及水体中全氟化合物检测方法的新技术。步骤为：第一步，人工抗原的合成。第二步，多克隆抗体的筛选与鉴定。第三步，免疫亲和柱的研制。第四步，超高效液相色谱串联质谱检测方法的建立和优化。该技术提供一种快速检测环境中全氟化合物残留的方法，更好地提高了检测灵敏度，保证了对样品检测的准确性。适应当前对全氟化合物残留检测的需要，便于开展对环境中实际样品中全氟化合物的残留检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，尤其涉及乳制品以及水体中全氟化合物检测方法的新技术。步骤为：第一步，人工抗原的合成。第二步，多克隆抗体的筛选与鉴定。第三步，免疫亲和柱的研制。第四步，超高效液相色谱串联质谱检测方法的建立和优化。该技术提供一种快速检测环境中全氟化合物残留的方法，更好地提高了检测灵敏度，保证了对样品检测的准确性。适应当前对全氟化合物残留检测的需要，便于开展对环境中实际样品中全氟化合物的残留检测。【专利说明】
本专利技术涉及一种免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，尤其涉及乳制品以及水体中全氟化合物检测方法的新技术。
技术介绍
全氟化合物(Perfluorinated compounds, PFCs)以其优良的热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性能，被大量应用于聚合物添加剂、润滑剂等诸多工业生产和生活用品中。全氟辛烧磺酸(Perfluorooctane Sulphonate, PF0S)和全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid, PF0A)是代表性的 PFCs。2009年5月联合国环境规划署及《关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约》第四次缔约方大会就减少并最终禁止使用9种严重危害人类健康与自然环境的有毒化学物质达成共识。这9种新的POPs就包括PFOS及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟。由于PFCs的C-F键能极大，在正常环境条件下很难降解，不能被传统的污水处理方法有效去除。Alexander G.P.估算1970-2002年间全球全氟辛基磺酰化合物的产量为9.6-12.25万吨，其中海洋表层中存在量估计为235-1770吨。所以PFCs所造成的全球性环境污染已成事实。随着我国乳业的快速发展，乳制品产量和人均消费量大幅度增加，人们对乳品的安全问题提出更高的要求。乳品中全氟化合物污染对人体健康的危害，属于长时期、微剂量、慢性细微毒性效应，可以导致人体生理生化或者自然免疫功能缺陷、致畸、致癌、致突变等问题。控制乳制品中PFCs污染，确保乳品安全，正日益受到关注，其中奶牛饲料原料和饮用水受PFCs污染是导致牛乳制品中PFCs残留的重要原因。对于PF0S/PF0A等PFCs造成的环境污染，尽管目前国内外已经做了许多研究工作，可是深度和广度仍远远不够，分析方法尚不够成熟，复杂环境、生物及食品样品的分析方法需要进一步完善，经国家标准化管理委员会网站查询表明，未见PFCs残留检测标准方法。PFCs检测方法研究中对样品的前处理是一个至关重要的环节。因为PFCs具有疏水疏油的双重性，属于痕量环境污染物，而且环境基质如生物样品往往都成分复杂，所以样品前处理较困难，已成为制约环境监测和深入研究这类物质环境行为的重要因素之一。目前用于PF0S/PF0A环境样品前处理的技术主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。LLE是传统的萃取方法，尽管方法成熟，可是存在如界面易乳化，耗费溶剂，操作烦琐，实验误差大的缺点。SPE是当前主流的萃取手段，反相C18柱及离子交换HLB柱是使用较多的SPE柱。这些SPE柱尽管萃取效果好于LLE，可仍然存在一些缺点:SPE柱价格较高，虽然理论上可以重复使用，但由于环境样品的复杂性，往往很少重复使用，使用成本较大；商品化SPE柱的填料易被复杂样品污染堵塞，柱效下降；PFCs极性差别大，反相或离子交换SPE填料并不适合所有的PFCs萃取，如反相吸附剂对小分子极性化合物没有足够的保留，复合弱离子交换吸附剂尽管兼顾离子交换和反相机制，效果好于反相吸附剂，可是对于组织中ClO以上全氟酸的回收率却低于50%。近年来，针对LLE、SPE萃取技术的不足，科学家们不断地改进，已形成了液-固萃取、加速溶剂萃取、超声萃取、固相微萃取等新技术。免疫亲合色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一项颇具发展潜力的样品前处理技术，其原理是利用抗原与抗体之间的高亲合、高特异而且可逆的“锁-钥匙”结合特性和柱层析色谱的差速迁移理论建立的分离富集方法。IAC具有选择性高、富集能力强、可重复使用的优点，能够满足痕量小分子化合物的检测要求。IAC在农药、兽药残留等领域应用的研究较多，部分IAC已经商品化。在环境科学领域，与IAC相关的免疫检测技术研究已经取得一定成果，而有关IAC用于乳制品样品前处理的研究报道却很少。Weilin LShelver最近报道了用于环境多溴联苯醚(PBDEs)检测的酶联免疫吸附方法(ELISA)，检测限与GC-NC1-MS相当，可达到0.lppb。研究数据表明ELISA可用于环境、生物样品的PBDEs检测，回收率与仪器方法相当。然而，ELISA方法存在不能区分相似结构PBDEs的缺点，这恰说明抗体的宽识别能力，提示IAC技术实际应用的可行性。E.Eljarrat报道了用于二噁英提取的IAC技术。该技术可以选择性提取五种ppt级的二噁英，并且与传统的前处理方法相比，IAC可以使处理速度提高20倍，节约100倍的有机溶剂。综上所述，有关与PFCs相似小分子化合物如长链脂肪酸或环境有机污染物如溴代联苯醚、二噁英等的人工抗原合成、特异性抗体筛选、IAC柱的制备与应用等技术已经比较成熟，可以为本课题所借鉴。经查新检索，尚未见用于PFCs的免疫检测方法及样品前处理IAC的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备免疫亲合色谱的抗体，实现色谱前处理中PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的富集浓缩；运用液相色谱-质谱连用对乳制品中PFCs进行试验参数探索，定性定量分析并建立典型PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的标准曲线，提供最佳分离鉴定效果。一方面，本专利技术提供了一种制备PFCs及其衍生物免疫亲合色谱柱的方法，该方法的具体步骤为:(I)人工抗原的合成a、PF0S/PF0A等PFCs及其结构类似物二羧基或二磺酸基PFCs，通过混合酸酐法与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工抗原。b、人工抗原的纯化及鉴定:采用透析的方式进行纯化；通过HPLC、MS、SDS-PAGE凝胶电泳、IR等鉴定手段对所合成的人工抗原进行鉴定，判定偶联效果，计算结合比。(2)多克隆抗体的筛选与鉴定将合成的PFCs-BSA人工抗原注入大白兔，约间隔7_10天注射一次，30天后，取血清进行抗体的特性鉴定。抗体特性及效价采用包被PFCs-OVA的间接竞争ELISA方法，利用酶标羊抗兔抗体进行测定。对于阳性高效价的抗体血清进行收集，并经聚丙烯凝胶电泳或琼脂双扩进行抗体纯化。纯化后抗体效价、特异性测定采用ELISA进行测定。(3) IAC柱的研制将抗体与活化的SepharoseCL_4B偶联，乙醇胺封闭未偶联的活性位点，获得特异性免疫吸附剂。将免疫吸附剂装柱，平衡，然后进行柱容量、选择性、富集效率、稳定性测试，洗脱条件的建立，回收率、重复性测定等。在本专利技术的优选实施过程中，前述的柱容量、选择性、富集效率、稳定性测试，洗脱条件的建立过程如下:(I)柱容量的选择:分别将含3ng、20ng、100ng、150ng、300ng的PFOS标准品的50m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳制品中全氟化合物的免疫亲合色谱?超高效液相色谱?质谱连用快速检测方法，其特征在于，制备免疫亲合色谱的抗体，实现色谱前处理中PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的富集浓缩；运用液相色谱?质谱连用对乳制品PFCs进行定性定量分析并建立典型PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的标准曲线，提供最佳分离鉴定效果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱江，郭小品，卢聪，罗启仕，杨洁，孟梁，朱杰，郭琳，李忠元，张长波，李青青，王旌，高洁，朱悦，
申请(专利权)人：上海市环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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