一种L‑异亮氨酸的发酵及分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑异亮氨酸的发酵及分离纯化工艺。本工艺以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)JHI3‑156为出发菌种，经N

【技术实现步骤摘要】
一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法
本专利技术涉及诱变选育L-异亮氨酸高产菌株及利用该菌株发酵制备L-异亮氨酸的方法，属于生化工程领域。
技术介绍
1901年，Fischer在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸(L-Isoleucine)化学名为β-甲基-a-氨基戊酸。由于在a位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，自然界中主要是L-异亮氨酸，研究表明，其余三种均无营养价值。此外，L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，在人体的生长代谢中占有十分重要的地位，若人体中长期缺乏异亮氨酸，可影响到机体的生理机能，导致代谢紊乱、机体抵抗力下降等。L-异亮氨酸作为畜禽必需氨基酸对动物有特殊营养作用，主要是由于其具有特殊的生理功能如：调节蛋白质代谢，增强免疫机能，改善泌乳性能，氧化供能，神经调节功能，所以作为支链氨基酸的研究倍受关注。L-异亮氨酸等氨基酸和高级脂肪酸制成的表面活性剂、抗菌剂具有毒性低、刺激小、柔软、抗静电、杀菌等性能，可用于制成护肤品、护发剂等化妆品。L-异亮氨酸生产方法有提取法、合成法和生物发酵法三类。提取法是应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-异亮氨酸，分离效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高且不易提取分离，没有应用于现代化大工业生产。合成法主要有化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，但是由于异亮氨酸在a位和β位具有两个不对称碳原子，且存在这四种旋光异构体，故很难廉价制造纯度高的L-异亮氨酸，大多数合成法所得均为外消旋体，须经外消旋拆分，生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。但近年来，通过甘氨酸酯Schiff碱衍生物羟基化反应，合成a-氨基酸的研究工作引人注目。以甘氨酸为原料，与无水乙醇及氯化亚砜作用，制得甘氨酸乙醋盐酸盐。再在二氯甲烷介质中，与三乙胺、苯甲醛反应生成苯亚甲氨基乙酸乙酯(以下简称Schiff碱)。再采用微波辐射，相转移催化技术，使苯亚甲氨基乙酸乙酯与仲溴丁烷形成烷基化产物。酸性水解，分离纯化后得异亮氨酸。合成的异亮氨酸产率为56.2％，纯品产率为23.7％，纯度为89.1％。采用6mol/L盐酸代替稀、浓盐酸两步水解法，简化烷基化物后处理步骤，使该合成法具备工业应用前景。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低，反应条件温和、环境污染较小及易实现大规模生产等优点，故目前在工业生产上被广泛实施。生物发酵法包括添加前体物发酵法和直接发酵法等。添加前体物发酵法又称微生物转化法，是以葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加a-氨基丁酸、a-羟基丁酸、a-酮基丁酸和D-苏氨酸等前体物质，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸，由于前体物质稀少且价格昂贵，目前已很少被采用。直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。国内外大多数厂家均采用直接发酵法生产L-异亮氨酸。目前，国内尚处于研究与小规模生产阶段，菌株产酸水平不高，生产水平和产量远不能满足市场需求。目前国际上日本生产L-异亮氨酸占有垄断地位，厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30～35g/L，提取率60～70％。目前全世界合计年产量400～500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸～直是高价氨基酸，国际市场医药级价格高达60～80美元/kg。国内售价由于日本向中国倾销而逐年下降，目前医药级价格约650元/kg。我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，90年代初正式工业化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20～22g/L，总得率为40～50％。江西省鹰潭生物化学制品厂是采用无锡轻工大学(现江南大学)技术最早生产L-异亮氨酸的厂家。目前国内生产L-异亮氨酸的厂家还有湖北省宜昌三峡药业有限责任公司、无锡晶海氨基酸有限公司、江苏张家港亚太氨基酸有限公司等。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还较低。本专利技术通过N+注入、紫外线复合诱变及乙硫氨酸抗性筛选获得了生产L-异亮氨酸的高产菌株——乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)JHI4-102，建立了一种利用该菌株发酵和分离提取L-异亮氨酸的生产工艺，具有产酸率高、提取收率高，产品质量好、纯度高的优点。该菌株已于2013年8月30日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.8091。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种新的短杆菌属的乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)，该菌具有提高L-异亮氨酸产率的能力。本专利技术需要解决的技术问题之二是提供一种利用上述菌种发酵及分离提取L-异亮氨酸的生产方法，通过如下技术方案实现，具体步骤顺序如下：1、高产菌株筛选液体完全培养基中接种斜面保存的新鲜乳糖发酵短杆菌JHI3-156，摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中离心一次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。平皿中加入制备的菌悬液0.2mL，涂布均匀，无菌操作台中自然晾干，形成菌膜，镜检。将样品培养皿放入低能加速器(离子注入机)小靶室，打开培养皿盖，靶室抽真空，用氮离子(N+)进行注入。离子注入后，加入无菌PBS缓冲液，用橡胶块充分擦洗(重复两次)，将洗脱液置入含玻璃珠的大离心管中，充分振荡，待用。按注入剂量，分别取0.1mL处理后菌悬液稀释同样的倍数，分别涂布在0.8％Eth基本培养基平板上，然后放入28℃的恒温培养箱中培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到菌株JHN224。液体完全培养基中接种斜面保存的新鲜JHN224，摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中，离心三次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。用无菌玻璃平皿装入10mL菌悬液，在磁力搅拌器作用下用紫外灯照射，取处理后菌悬液0.1mL，在红灯下用适量无菌PBS缓冲液稀释。稀释后的菌液涂皿，28℃培养箱过夜培养(避光)。培养一定时间后，在菌落计数器下计数，并将各照射时间下的单位体积存活菌数和照射0s(即原菌液)的单位体积菌数作对比，计算其各自的存活率。取0.5mL紫外线诱变的菌液，无菌操作加入到含5mL0.6％Eth(乙硫氨酸)基本培养基的试管中黑暗培养36h，然后将菌液稀释到一定合适浓度，涂布在含0.6％Eth的基本培养基平板上，放置在28℃的培养箱中培养4天，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到L-异亮氨酸高产菌株——乳糖发酵短杆菌JHI4-102，遗传稳定性试验表明该菌株遗传性能稳定，甘油保存。2、发酵罐发酵挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按5～20％接种量转入50～70L自动控制发酵罐中，装液量30～70％，通风量100～3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L?异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，主要通过以下步骤实现：1)高产菌株筛选：新鲜乳糖发酵短杆菌JHI3?156用一定注入能量和注入剂量的氮离子(N+)注入，在0.8％Eth(乙硫氨酸)基本培养基平板上培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到菌株JHN224。新鲜的JHN224用紫外灯照射诱变，在含5mL0.6％Eth基本培养基的试管中黑暗培养后再在含0.6％Eth的基本培养基平板上培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到L?异亮氨酸高产菌株——乳糖发酵短杆菌JHI4?102(CGMCC?No.8091)，具有良好的遗传稳定性。2)发酵罐发酵：菌种经种子逐级扩大培养，一定条件下50L～100L发酵罐发酵。3)提取纯化：发酵液经壳聚糖预处理后超滤，超滤液真空浓缩，乙醇结晶和重结晶，真空干燥，得到白色鳞片状的L?异亮氨酸精品。

【技术特征摘要】
1.一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，主要通过以下步骤实现：1)获得发酵菌株：乳糖发酵短杆菌JHI4-102，保藏编号：CGMCCNo.8091；2)发酵罐发酵:菌种经种子逐级扩大培养，一定条件下50L～100L发酵罐发酵；3)提取纯化：发酵液经壳聚糖预处理后超滤，超滤液真空浓缩，乙醇结晶和重结晶，真空干燥，得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品；所述发酵罐的发酵条件为，接种量5～20％，50～100L发酵罐装液量30％～70％，通风量100～300L/h，搅拌转速300～800r/min，培养温度28～32℃；采用补料分批发酵，在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加0.5～1L480g/L葡萄糖补料液；每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加0.5～1L的补料液，直至10L补料液全部补完为止；在发...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨旭锦，石慧，
申请(专利权)人：北京明新高科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：