一种酶法合成L-茶氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法合成L-茶氨酸的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过化学合成获得γ-谷氨酰转肽酶的基因，并以大肠杆菌为宿主菌构建一种过量表达γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，以重组酶作用于不同浓度的谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，在pH9.5～10.5、37～50℃条件下，可以高效产生茶氨酸。本方法有酶源制备方法简单、成本低，酶量大，茶氨酸生产方法简单、转化率高、产量高、时间短等优点，利于工业化放大生产。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成L-茶氨酸的方法
本专利技术涉及一种L-茶氨酸的合成方法，具体是一种利用微生物酶以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物制备L-茶氨酸的方法，属于生物工程

技术介绍
茶氨酸，又称(C7H14O3N2，又称γ-谷氨酰乙胺)，是存在于绿茶中的一种非必须氨基酸，也是茶叶的重要风味物质。饮茶一直以来被人誉为有益身心，放松明智的健康食品，近年来，越来越多的科学研究证明了茶氨酸是绿茶中的活性物质之一，在生理和药理方面有减轻精神压力、提高认知行为和学习能力、抑制肥胖、减低血压、增强免疫力以及防止肿瘤发生的作用。因此，茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛需求。茶氨酸的主要生产方法有直接提取法、化学合成法和生物法。传统工业中，人们通过通过萃取等手段从干绿茶叶片中直接提取茶氨酸，但由于在干茶叶中，茶氨酸含量仅为茶叶重量的1.5%～2%，因此，此法得率低、成本高，不适于大规模工业化生产。随着工业化的发展，人们专利技术了化学合成法生产茶氨酸的工艺，化学合成法只要分为三条合成路线：（1）吡咯烷酮酸（焦谷氨酸）法，即用L-吡咯烷酮酸和乙胺生成茶氨酸。主要代表有：1942年，以色列人N.Lichtenstein首次在实验室中用乙胺和L-吡咯烷酮酸在水溶液中反应，合成茶氨酸，但收率低。1951年，日本人桥爪斌改进了合成方法，用L-吡咯烷酮酸和无水乙胺在低温下反应，提高了反应收率。1961年，Yamada等人将L-吡咯烷酮酸先生成铜盐后与纯乙胺反应，利用反应物与生成物的溶解度差异，提高差率。2004年，陈新等人通过营造惰性环境，使L-茶氨酸收率达58%。（2）N-取代的谷氨酸酯的乙胺解反应产生N-取代茶氨酸。（3）N-取代的谷氨酸酐法。该法先利用保护基将谷氨酸的α-氨基保护起来使其分子内脱水形成环状谷氨酸酐后，直接与乙胺作用生产N-取代茶氨酸，再除去保护集团获得茶氨酸。化学合成法主要存在反应时间长、收率低等缺点，同时由于需要采用高压、惰性气体保护和保护集团等方式，增加生产成本。近年来，微生物酶法成为茶氨酸合成新趋势。酶法生产茶氨酸主要利用细菌来源的谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰转肽酶。实例如下：（1）谷氨酰胺酶：1998年，TachikiT等人利用PseudomonasnitroreducensIFO12694来源的谷氨酰胺酶，利用700mML-谷氨酰胺和1.5M乙胺在30℃，pH11下7小时，获得38.57%的底物转化率；随后，AbelianVH等人利用PseudomonasnitroreducensIFO12694的固定化细胞进行连续生产，实现了95%的底物转化率；但多数谷氨酰胺酶的最适作用pH在中性，存在在碱性条件下酶的稳定性差，同时酶的热稳定性不佳等缺点；（2）谷氨酰胺合成酶：利用合成酶进行茶氨酸的生产要消耗能量，因此，Yamamoto等人利用PseudomonastaetrolensY-30来源的谷氨酰胺合成酶与啤酒酵母中的糖酵解途径中相关酶偶联，形成ATP再生系统生产茶氨酸，以200mM谷氨酸钠盐和600mM的乙胺反应，获得85%的底物转化率；谷氨酰胺合成酶的应用需要提供额外ATP功能，反应只能在细胞中进行，反应周期长达数十小时，使用受到限制；（3）γ-谷氨酰转肽酶：2002年，日本人H.Suzuki等首次利用大肠杆菌来源的γ-谷氨酰转肽酶在水溶液欧诺中以L-谷氨酰胺和乙胺为底物，获得60%底物转化率；帅玉英等利用从中国传统发酵食品中分离筛选得到的BacillussubtilisSK11.004的γ-谷氨酰转肽酶，以20mM谷氨酰胺和200mM的乙胺反应，获得80%的底物转化率，应用γ-谷氨酰转肽酶进行茶氨酸生产具有反应过程简单，反应时间短等优点，但存在转化率不高，野生酶发酵酶活力低等缺点，在高底物浓度下的应用研究较少，阻碍其工业化应用过程。目前为止，利用微生物来源或基因工程来源的γ-谷氨酰转肽酶作为催化剂、在适宜工业生产规模的高底物浓度下进行茶氨酸生产获得较高底物转化率的例子还未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种酶法合成L-茶氨酸的方法，包括以下步骤：（1）以高产γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵生产γ-谷氨酰转肽酶；（2）以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂，以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。所述高产γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，是将枯草芽孢杆菌168的γ-谷氨酰转肽酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达获得，包括以下步骤：（1）根据NCBIGeneID：940001所示的基因序列，通过化学合成法得到γ-谷氨酰转肽酶基因；（2）将目的基因扩增后通过割胶回收，与pMD18-Tsimple载体连接，转化大肠杆菌JM109，获得质粒ggt/pMD18-Tsimple，将质粒测序验证；（3）将测序正确的质粒ggt/pMD18-Tsimple载体和pET20b(+)空载体进行双酶切，割胶回收ggt基因片段和pET20b(+)线性载体片段后将两片段连接并转化大肠杆菌JM109，获得质粒ggt/pET20b(+)；（4）将质粒ggt/pET20b(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得ggt-pET20(b)/E.coliBL21(DE3)。所述以高产γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵生产γ-谷氨酰转肽酶，包括以下步骤：将基因工程菌ggt-pET20(b)/E.coliBL21(DE3)接种于含有Amp的LB液体培养基，37℃下培养8～10h；以5%接种量转接至含0.75%甘氨酸的TB（含Amp）液体培养基，37℃培养3h；用0.4mM/LIPTG诱导，降温至25℃恒温培养40～48h诱导产酶，发酵结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。所述催化反应是在反应器中分别添加L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，用乙胺水溶液65%～70%（CP）调节pH，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在200rpm的水浴摇床中进行反应。所述L-谷氨酰胺的初始浓度为20mM～1000mM。所述乙胺盐酸盐的初始浓度为0.5M～5M。所述重组γ-谷氨酰转肽酶的浓度为0.2U/ml～9.0U/ml。所述反应在pH9.5～10.5、37～50℃下反应2～5h。本专利技术通过选择高底物转化率的菌株进行异源表达，获得单位酶活较高的发酵酶液，弥补了野生菌酶活单位低的缺点，为低成本大量制酶奠定基础。同时，本专利技术获得的γ-谷氨酰转肽酶在碱性pH反应条件下具有良好的活性和稳定性，同时，热稳定性良好，在50℃下半衰期高达130h，弥补了其他酶种在碱性反应条件下稳定性差的缺点。用该酶进行酶反应生产茶氨酸，具有反应方法简便、不需要提供额外生物能量、反应时间短等优点，在不同底物浓度下，均能得到对应底物浓度下的高底物转化率，为工业化放大生产奠定基础。附图说明图1重组酶在50℃下的温度稳定性图2重组酶的最适pH图3重组酶的pH稳定性具体实施方式实施例1：ggt-pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)的构建（1）根据NCBI上枯草芽孢杆菌168的γ-谷氨酰转肽酶基因(NCBIGeneID：940001)序列，通过化学合成得到γ-谷氨酰转肽酶基因，以此基因为模版，设计引物P1、P2，P1：5’–ATCCATGGATAAAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法合成L?茶氨酸的方法，包括以下步骤：以高产γ?谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵生产γ?谷氨酰转肽酶；以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂，以L?谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物合成L?茶氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成L-茶氨酸的方法，包括以下步骤：以高产γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵生产γ-谷氨酰转肽酶；以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂，以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸；所述高产γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌，是将枯草芽孢杆菌168的γ-谷氨酰转肽酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达获得，包括以下步骤：(1)根据NCBIGeneID：940001所示的基因序列，通过化学合成法得到γ-谷氨酰转肽酶基因；(2)将目的基因扩增后通过割胶回收，与pMD18-Tsimple载体连接，转化大肠杆菌JM109，获得质粒ggt/pMD18-Tsimple，将质粒测序验证；(3)将测序正确的质粒ggt/pMD18-Tsimple载体和pET20b(+)空载体进行双酶切，割胶回收ggt基因片段和pET20b(+)线性载体片段后将两片段连接并转化大肠杆菌JM109，获得质粒ggt/pET20b(+)；(4)将质粒ggt/pET20b(+)转化大肠杆菌BL21(DE3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，陈星奕，宿玲恰，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：