桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法，它涉及桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法。本发明专利技术要解决现有制备桦木醇，分离桦木酸存在的收率低，纯度和转化率不高的问题，本发明专利技术方法为：对桦树皮原料在碱性条件下进行瞬间的高温高压处理，采用乙醇进行提取，过滤，结晶，再用氯仿/乙醇溶解重结晶，然后桦木醇氧化至桦木酮酸，将桦木酮酸还原至桦木酸；或者将枯草芽孢杆菌、高大毛霉或黄绿蜜环菌发酵菌液与桦木醇及缓冲液共同培养使桦木醇转化成桦木酸。本发明专利技术的方法工艺简单，产品纯度高，操作方便，成本低，经济效益显著。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
最近二十年，羽扇豆烷系列化合物的三萜类用于多种疾病的治疗。其中桦木醇为主要的一种三萜类化合物，广泛地分布在自然界中，并且被应用于好多领域。因此已有大量文献报告桦木醇及其衍生物研究和应用的有重要性。桦木醇及其衍生物的分子结构如下:权利要求1.桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法是按照以下步骤进行的: 一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为20(T240°C，压力为1.2^3.4MPa的条件下处理3 5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105°C温度下干燥f2h，得处理原料； 二、在温度为75°C条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取I次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为5(T60°C条件下过滤，收集滤液，在温度为4°C条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4°C的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇 结晶品，然后在温度为25°C 30°C、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为lg:l(Tl5mL ;步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为Ig:9 llmL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1:1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌； 其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下: a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV ;注入剂量为60X2.6 X IO13 200 X 2.6 X 1013ions / cm2、靶室真空度为2 X 10 ,脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28°C条件下，培养4飞山挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28 V的条件下，活化培养4 5(1，制成含孢子数约KTlO7Cfu / mL的孢子悬浮液； b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28°C、转速为120r / min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28°C、转速为120r / min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50%的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化； 所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30%的马铃薯、2%的葡萄糖、3%的琼脂和余量的水组成； 发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30%的马铃薯、2%的葡萄糖和余量的水组成； 底物溶液为质量百分含量为90%的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7 8mg /mL的溶液。2.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤四中所述的预备培养具体操作如下:取4mnT5mm2斜面培养菌丝体，采用无菌水将黄绿蜜环菌丝体稀释成孢子数含量为106cfu/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液按1%的接种量接种于液体培养基中，在转速为120r/min，温度为25°C 30°C的条件下恒温振荡培养48h，得预备培养液；其中，液体培养基为马铃薯综合培养基，按质量百分含量计，是由2%的可溶性淀粉、I %的葡萄糖、0.5%的蛋白胨、0.5%的酵母膏、0.3%的尿素、0.2%的ΚΗΡ04、0.1%的MgSO4.7Η20、0.003%的 FeSO4 和余量的水组成，pH 为 7.0。3.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为lg:5 8mL。4.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为Ig:10mL。5.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株50%的高转化率菌株。6.桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法 是按照以下步骤进行的: 一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为20(T240°C，压力为1.2^3.4MPa的条件下处理3飞min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105°C温度下干燥f2h，得处理原料； 二、在温度为75°C条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取I次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为5(T60°C条件下过滤，收集滤液，在温度为4°C条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液在温度为4°C的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 四、取步骤三得到的桦木醇结晶品，在搅拌条件下，用丙酮溶解，然后冷却至50C 10°C，按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1:5 7的比例混合均匀，在温度为20°C条件下反应3h，过滤，去除沉淀，收集滤液减压干燥，将干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有机相乙酸乙酯，依次用等体积的蒸馏水和等体积的质量百分含量为10%碳酸氢钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，得桦木酮酸粗品；用8 10倍体积乙醚溶解桦木酮酸粗品，过硅胶层析柱，收集柱层析液，减压干燥，得桦木酮酸纯品，然后用硼氢化钠/四氢呋喃还原，生成桦木酸粗提物；将桦木酸粗提物与甲醇按质量体积比为Ig:20mL的比例混合，加热煮沸15 20min，冷却至室温重结晶，即得桦木酸； 其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为lg:l(Tl5mL ;步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为Ig:2飞mL ;步骤四中所述的固相物与乙酸乙酯的质量体积比为Ig:10mL，桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为Ig:3 5mL。7.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为lg:5 8mL。8.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为Ig:3.5mL。9.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木本文档来自技高网...
【技术保护点】
桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法是按照以下步骤进行的：一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料；二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品；三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成；四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌；其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下：a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×1013~200×2.6×1013ions／cm2、靶室真空度为2×10?3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约105~107cfu／mL的孢子悬浮液；b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40?50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化；所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成；发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成；底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7~8mg／mL的溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宏伟，王雷，王东凯，邢岩，李鹏，林琳，杨志兴，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院高技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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