本发明专利技术提供一种在恒温热源下进行聚合酶链式反应的方法及装置。更具体地，首先，本发明专利技术涉及基于Rayleigh-Benard(雷诺本纳德)原理，对反应试管特定区域提供或移走热量，以建立反应管内试剂自下而上的温度梯度，在反应试剂不均匀受热下自发进行对流，并在流经不同温度区域时发生相应PCR扩增的方法。本发明专利技术提供一种实现上述方法的反应及实时荧光检测装置。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚合酶链反应方法及装置。更具体地，本专利技术涉及基于热对流建立液体自下而上的温度梯度的原理，在液体受热自发进行对流，并在流经不同温度区域时发生相应PCR扩增的方法，以及相应的装置。
技术介绍
:聚合酶链反应技术(以下简称PCR技术)，是一种体外快速扩增DNA的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近IO9倍，PCR是体外大量获得目的DNA片段的方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA进 行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测及产前诊断、法医研究等。美国专利4，683，202 ;4，683，159 ;4，800，159 ;4，965，188 号对 PCR 技术做出了描述。DNA的扩增在体内是由细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’ -3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。而DNA分子在体外的PCR扩增模拟了体内的三个步骤:首先，在大约95 °C的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应；然后，温度迅速降到大约50-65°C的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应；退火反应结束后，温度要迅速升高到72°C左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程， 就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将热通过反应管传递至PCR反应液。这种装置的缺陷是:反应体积较大，即系统通常具有较大的体积和热容，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热通过反应管传递至PCR反应液，因此，PCR难以实现高效和高通量。而为了加快升降温的速度，也使得PCR仪器制造的困难加大，仪器成本大幅度提高。在此基础上，20世纪九十年代，研究者们开始将微流控芯片技术应用于PCR扩增。微流控芯片技术是近十年来迅速发展起来的一种新的微型分析系统，它采用微加工技术在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡胶材料上蚀刻出微米尺寸的反应管道及分析组件，由于各种分析过程可在微米尺寸的结构中完成，一方面可使珍贵的生物试样与试剂消耗降低到微升生至纳升级，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，实现高通量的检测。PCR装置的微型化不仅降低了 PCR样品的消耗量，而且较低的热容量显著提高了系统的热传导效率，使PCR反应速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系统主要有两种形式:微室静态型PCR芯片和连续流动型PCR芯片。前者是传统PCR的微型化，即将反应混合物固定在反应池中，依赖于温度控制装置的温度循环变化进行热循环扩增，由于是传统PCR的微型化，体积和热容减少，因此反应时间大大减少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通过微加工形成逶迤形流路，在一定推动力的作用下，使PCR反应液连续流经三个不同的温区，完成变性、退火和延伸过程，其优点是其反应温度无需来回反复地快速升降。虽然这两种PCR微流控芯片系统能够快速、高效扩增目的DNA片段，并已成功的实现了与毛细管电泳分离，实时荧光检测以及数组芯片杂交等过程的集成化。但前者其实只是传统PCR的微型化，仍没有突破依靠加热、冷却模块来反复升降温的模式，没有彻底解决升降温的耗时长问题；而后者虽然解决了反复升降温的耗时问题，却带来新的问题，即系统通常包含复杂的液体驱动系统，一方面增加了仪器及反应容器制作的复杂性和成本，另一方面操作比较复杂，限制了其广泛应用。21世纪初，出现了一种新型的PCR扩增方法，利用自然对流即雷诺-本纳德对流原理进行PCR扩增的方法。该技术是将PCR反应液置于一个封闭的柱形反应腔内，反应腔的上下表面分别进行恒温控制，通常上端温度为60°C，下端温度为97°C，通过上下表面的温差驱动液体经过不同的温区，实现PCR扩增。这种方法不需要改变器件的温度，也不需要外加驱动来实现样品的流动，只需要一个反应腔，并控制控制其上下两端的温度为恒温，就可以实现PCR扩增。但该方法依然存在缺陷:首先，试剂需填满整个反应腔，需密封，存在潜在的泄漏问题；其次，试剂直接注入反应腔内，导致加热器与试剂直接接触，存在潜在的污染问题。因此，现有技术中迫切需要一种新的聚合酶链反应扩增方法以及相应的装置，以解决其中存在的易污染、反应不稳定的问题。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种通过聚合酶链反应扩增核酸的方法，其中包括:(I)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物；(2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流；(3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应，扩增核酸。在一个实施方案中，所述方法还包括对扩增产物进行检测，例如进行实时监测。优选地，所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针，从而能够进行实时监测。本专利技术在另一方面提供了一种核酸扩增反应装置，其中包含:(a)扩增反应容器，其中含有核酸扩增试剂；(b) —个或多个可控制温度的恒温装置；和(c)扩增反应容器间的隔热装置；其中通过不同的恒温热源接触在扩增反应容器的上下部位，建立管壁和管内垂直空间的温度梯度分布。任选地，本专利技术的装置还包含:(d)实时检测装置，例如荧光检测>J-U ρ α装直。本专利技术的出现，解决了现有技术中各种方法的缺陷，它反应速度快；仪器与反应容器制作工艺简单、成本低廉；操作方便，无须密封，不与加热器直接接触，没有潜在的泄露与污染问题。在本专利技术的方法和装置内，依据热对流原理，管内的PCR试剂会建立稳定的自下而上的温度梯度，进而自发驱动试剂产生对流运动，试剂在流动过程中会经过不同的温度区域，从而达到PCR扩增的目的。在一个优选的实施方案中，在扩增的同时，本专利技术的特殊装置可以采集扩增时及扩增后的荧光信号，可取代琼脂糖凝胶电泳的鉴定步骤，达到实时监测的目的。首先，因不需反复升降温，本专利技术最终将提供一种在机构设计上更为简单，硬件装置上更为便宜的方法与装置，无需传统PCR仪的诸多复杂机构和电控，如精密温控的电路板、通过消耗电能来改变温度的装置等。因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过热对流进行聚合酶链式反应的方法，该方法包括：(1)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物，任选地所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针；(2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流；(3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应；以及；(4)任选地对热对流聚合酶链式反应产物进行检测，例如实时监测。
【技术特征摘要】
1.一种通过热对流进行聚合酶链式反应的方法，该方法包括: (1)提供一端开口的反应容器，在其中加入核酸扩增反应物，任选地所述聚合酶链反应产物中包含荧光染料或探针； (2)在该开口容器内部或外部提供一个或多个可控制温度的恒温装置，所述恒温装置被构造成用于提供高于变性的温度，和供给或移走热量控制退火与延伸的温度，并且通过接触在反应容器的不同部位，建立管壁和管内空间的上下温度梯度分布以使管内液体产生稳定的对流； (3)利用管内液体对流进行聚合酶链式反应；以及； (4)任选地对热对流聚合酶链式反应产物进行检测，例如实时监测。2.权利要求1的方法，其中所述恒温装置是一个或多个。3.权利要求1的方法，其中在反应容器内，位于扩增反应物上方加入低密度的不易挥发物质，防止试剂蒸发并使光源穿透。4.权利要求1的方法，其中所述反应管具有高透明度的密闭盖，用于防止试剂蒸发并使光源穿透。5.权利要求1的方法，其中所述扩增反应物内包含有利建立热对流且不影响反应的化学物质。6.权利要求1的方法，其中增加扩增反应物体积以增加纵向的试剂反应空间。7.权利要求1的方法，其中温度控制方法利用固体、液体、气体、光线或是微波加热或冷却反应混合物。8.权利要求1的方法，其中还包括进行RNA反转录反应。9.权利要求1的方法，其中反应物在热对流循环中会有荧光物质插入到的双链DNA中用于监测。10.权利要求1的方法，其中在热对流循环中，特异的荧光探针被水解而产生荧光用于监测。11.权利要求1的方法，其中在热对流循环中，特异的荧光探针杂交于靶序列上，可用于监测...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛胜祥，周文彬，张师音，陈清瑞，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门万泰沧海生物技术有限公司，厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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