用于胞内递送分子的复合物制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，更具体的说，涉及一种融合蛋白及含有所述融合蛋白的复合物，其可用于胞内递送货物分子。本发明专利技术的融合蛋白及复合物能够实现货物分子从内吞小泡的高效释放，显著提升货物分子的细胞质递送效率。一旦在细胞质中可获得货物分子时，它们就可发挥与其相关的任何作用。因此，本发明专利技术的融合蛋白及复合物提供了用于影响细胞的生物学机制和途径的有效手段，其可用于研究、治疗、诊断等诸多领域。断等诸多领域。断等诸多领域。

【技术实现步骤摘要】
用于胞内递送分子的复合物


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，更具体的说，涉及用于胞内递送货物分子的融合蛋白及复合物。

技术介绍

[0002]细胞膜作为选择性透过性屏障对细胞存活和功能至关重要，虽然小分子物质可以通过细胞的天然过程或脂质双层的直接扩散穿过细胞膜，但是在大多数情况下，外源性的活性生物大分子等细胞内载物从细胞质膜的有效通过，仍然是细胞运送过程的主要障碍。因此，一种能够有效提高细胞内载物向活细胞运输效率的分子转运工具对于其在生物医药等领域的应用极为重要。
[0003]细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)是目前用于实现细胞摄取过程的最普遍和有效的载体之一。细胞穿膜肽，通常含有5-30个氨基酸，可以以化学交联、融合表达或非共价结合的方式携带生物大分子穿过细胞膜进入胞内。迄今，已有上百种来源于天然蛋白或人工合成的CPPs被报道并用于细胞内载物的胞内递送研究，根据其化学性质的不同，可以分为三类:(1)阳离子型，富含精氨酸和赖氨酸残基，在生理pH下具有强正电荷；(2)两亲型，包含极性和非极性区域，除了分布在整个序列中的赖氨酸和精氨酸外，它们还富含疏水残基，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸等；(3)疏水型，主要含有非极性氨基酸。CPPs通过其强正电荷或疏水基团与细胞膜表面负电荷或疏水脂双层相互作用，当携带小分子时可以采用非耗能的方式直接转位穿过细胞膜，当携带生物大分子时基本上采用能量依赖的胞吞作用(endocytosis)进入胞内。由于CPPs在介导入胞时用量低、转运所需时间段、剂量可控、操作简单以及毒副作用低等优点，目前CPP已在体外及体内被广泛应用于转运多肽、蛋白、寡核苷酸、质粒、脂质体和金属离子，小分子荧光，纳米颗粒等等。
[0004]尽管CPPs在转导生物大分子上具有诸多优势，但仍存在一些局限性，其中首先需要解决的是其较低的跨膜递送效率。目前普遍认为，在转导内载物入胞时，CPPs与细胞膜表面相互作用，然后通过细胞内吞(endocytosis)进入胞内。细胞内吞可根据其内吞机制的不同可分为四种主要方式:巨胞饮作用(macropinocytosis)、网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis)、胞膜窖/脂筏介导的内吞(caveolae/lipid raft-mediated endocytosis)以及不依赖于网格蛋白/胞膜窖的内吞(clathrin/caveolae-independent endocytosis)等。这些不同的细胞内吞方式最终都会生成内吞小泡(endosome)，并由早期内吞小泡(early endosome)向晚期内吞小泡(late endosome)单向成熟并伴随小泡内pH逐步降低，最终与溶酶体(lysosome)融合。细胞内载物需要在进入溶酶体之前从内吞小泡逃逸(endosomal escape)进入胞浆，否则，将最终进入溶酶体并被降解而不能发挥功能。已有研究表明，CPPs携带的生物大分子仅有1％能在内吞小泡逃逸成功，大部分最终导向溶酶体而被降解。因此，细胞内载物的小泡逃逸是CPPs胞内递送过程的关键限制因素，其效率决定了总体递送效率。
[0005]对于提升小泡逃逸效率，主要策略为在成熟酸化的过程中破坏小泡囊膜的完整
性，从而使其内容物(包括被递送的细胞内载物)释放到胞浆中。有报道可以通过在体系中加入缓冲剂，比如氯喹(chloroquine)，甲胺(methylamine)，或者氯化铵(ammonium chloride)，以物理性方式促进内吞小泡的渗透破裂，但因其较强的细胞毒性阻碍了在临床上的应用。而目前最有效的方式是利用来源于病毒、细菌、动植物或者人类的pH敏感肽(pH sensitive fusogenic peptides)。pH敏感肽含有一定比例的疏水氨基酸，且在低pH值的情况下会发生构象的剧烈改变。在CPPs介导细胞内吞后，内吞小泡在成熟酸化的过程中，一旦pH值下降到临界点，与CPPs偶联的pH敏感肽发生构象改变并与小泡囊膜的脂双层结合从而剧烈扰动磷脂双层膜的完整性，在其上形成小孔或导致囊膜裂解，最后将被转运的生物大分子释放进入胞浆。目前较为常用的pH敏感肽为流感病毒血凝素抗原茎部区的一段多肽(以下简称HA2)，以及基于HA2人工改造后毒性更低、破膜效果更好的INF7，二者与CPPs及蛋白分子融合表达后，能够提升转运蛋白分子的内吞小泡逃逸效率。然而，虽然融合pH敏感肽后的CPPs大分子胞内递送系统的内吞小泡逃逸效率确实得到提高，但相当一部分的被转运大分子仍留存在内吞小泡内(以荧光蛋白作为被转运大分子可见明显的点状分布)。
[0006]因此，仍然需要开发新的递送系统，以实现被转运的生物大分子从内吞小泡的高效释放。

技术实现思路

[0007]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现将pH敏感肽与特定蛋白酶识别序列联用作为递送载体能够显著提高货物分子从内吞小泡的释放，从而显著提升货物分子的细胞质递送效率，使货物分子充分发挥其相应的生物学功能。基于这些发现，本专利技术人开发了能够实现高效细胞质递送的载体系统。
[0008]融合蛋白
[0009]因此，本专利技术第一方面提供了一种融合蛋白，其包含细胞穿膜肽、pH敏感融合肽(pH-sensitive fusogenic peptide)以及蛋白酶识别序列，其中，所述蛋白酶选自弗林蛋白酶和/或溶酶体半胱氨酸蛋白酶。
[0010]在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：R-X
1-X
2-R
↓
(SEQ ID NO:1)，其中，X1为任意氨基酸，X2为K或R，
↓
表示切割位点。
[0011]在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：R-R-X
1-X
2-R
↓
(SEQ ID NO:2)。
[0012]在某些实施方案中，X1选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、天冬氨酸(N)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、辅氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。
[0013]在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：RRHKR
↓
(SEQ ID NO:3)。
[0014]在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：QSVASSRRHKR
↓
FAGV(SEQ ID NO:4)。
[0015]在某些实施方案中，所述溶酶体半胱氨酸蛋白酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶X、组织蛋白酶S、组织蛋白酶L、组织蛋白酶D或组织蛋白酶H。
peptides”或“转导肽(transduction peptide)”等本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其包含细胞穿膜肽、pH敏感融合肽以及蛋白酶识别序列，其中，所述蛋白酶选自弗林蛋白酶和/或溶酶体半胱氨酸蛋白酶。2.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述弗林蛋白酶识别序列包含R-X
1-X
2-R(SEQ ID NO:1)，其中，X1为任意氨基酸，X2为K或R；优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含R-R-X
1-X
2-R(SEQ ID NO:2)；优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:3所示的序列；优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述溶酶体半胱氨酸蛋白酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶X、组织蛋白酶S、组织蛋白酶L、组织蛋白酶D或组织蛋白酶H；优选地，所述溶酶体半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶L；优选地，所述组织蛋白酶L识别序列包含SEQ ID NO:6所示的序列。4.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中，所述蛋白酶识别序列包含弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列；优选地，所述蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6；优选地，所述蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。5.权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其中，所述pH敏感融合肽选自流感病毒HA2或其突变体(例如INF7，KALA或GALA)、蜂毒素(Melittin)，及其任意组合；优选地，所述pH敏感融合肽包含INF7；优选地，所述pH敏感融合肽包含如SEQ ID NO:8所示的序列。6.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞穿膜肽选自穿透素(Penetratin)、Tat衍生肽(例如，Tat(48-60)或Tat(47-57))、Rev(34-50)、VP22、转运肽(transportan)、Pep-1、Pep-7，及其任意组合；优选地，所述细胞穿膜肽包含Tat衍生肽，例如Tat(48-60)；优选地，所述细胞穿膜肽包含如SEQ ID NO:10所示的序列。7.权利要求1-6任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从N端至C端包含所述pH敏感融合肽、细胞穿膜肽和蛋白酶识别序列；或者，所述融合蛋白从N端至C端包含所述细胞穿膜肽、pH敏感融合肽和蛋白酶识别序列；优选地，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列，或者从N端至C端包含所述组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列。8.权利要求1-7任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含SEQ ID NOs:12-14任一项所示的序列。9.权利要求1-8任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白进一步包含特异性结合序列，所述特异性结合序列允许另外的分子(例如多肽、蛋白或核酸)与其发生特异性结合；优选地，所述特异性结合序列包含亮氨酸拉链，并且所述亮氨酸拉链能够与其反向序列形成异源二聚体；优选地，所述特异性结合序列包含亮氨酸拉链NZ或CZ；优选地，所述特异性结合序列包含SEQ ID NO:49或50所示的序列；优选地，所述特异性结合序列位于所述蛋白酶识别序列的C端。10.复合物，其包含权利要求1-9任一项所述的融合蛋白，以及货物分子；
优选地，所述货物分子选自核酸、肽或蛋白、糖类、脂质、化学化合物以及其任意的混合物；优选地，所述核酸选自DNA分子、RNA分子、siRNA、反义寡核苷酸、核酶、适体(aptamer)及其任意组合；优选地，所述货物分子包含可检测的标记；优选地，所述货物分子包含表位标签、报告基因序列和/或核定位信号(NLS)序列。11.权利要求10所述的复合物，其中，所述融合蛋白与货物分子是融合的，所述货物分子是肽或蛋白质；优选地，所述货物分子融合至所述融合蛋白的C端；优选地，所述复合物包含单链多肽，所述单链多肽从N端至C端包含所述pH敏感融合肽、细胞穿膜肽、蛋白酶识别序列和货物分子；优选地，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列，或者从N端至C端包含所述组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列；优选地，所述复合物包含单链多肽，所述单链多肽从N端至C端包含所述细胞穿膜肽、pH敏感融合肽、蛋白酶识别序列和货物分子；优选地，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列，或者从N端至C端包含所述组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列。12.权利要求10所述的复合物，其中，所述融合蛋白与货物分子化学偶联；优选地，所述化学偶联通过二硫键、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、胺键、硫醚键、醚键、酯键或碳-碳键实现；优选地，所述货物分子偶联至所述融合蛋白的N端或C端。13.权利要求10所述的复合物，其中，所述融合蛋白与货物分子非共价连接。14.权利要求13所述的复合物，其中，所述融合蛋白是权利要求9所述的融...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛胜祥，于思远，杨晗，潘海峰，任书玲，李廷栋，郭清顺，熊君辉，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：