改进的基因组编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供一种基因组编辑融合多肽，其包含CRISPR核酸酶结构域和转录激活结构域。本发明专利技术还提供编码所述多肽的多核苷酸或表达构建体，以及包含所述多肽、多核苷酸和/或构建体的基因组系统。本发明专利技术还提供用所述基因组编辑系统编辑细胞基因组的方法。统编辑细胞基因组的方法。统编辑细胞基因组的方法。

【技术实现步骤摘要】
改进的基因组编辑系统及其应用
专利

[0001]本专利技术涉及基因组编辑领域。具体而言，本专利技术涉及改进的基因组编辑系统及其应用。更具体而言，本专利技术提供一种基因组编辑融合多肽，其包含CRISPR核酸酶结构域和转录激活结构域。本专利技术还提供编码所述多肽的多核苷酸或表达构建体，以及包含所述多肽、多核苷酸和/或构建体的基因组系统。本专利技术还提供用所述基因组编辑系统编辑细胞基因组的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统已广泛和成功地用于多种真核物种的基因组工程。然而，在动物和植物细胞中，不同基因组位点的编辑效率差异很大。某些位点的低CRISPR/Cas9编辑效率限制了体内靶标的可用性，从而限制了进一步的应用。
[0003]与原核DNA不同，真核基因组DNA缠绕在组蛋白周围，并进一步压缩形成可能阻碍Cas9与其靶标结合的高阶染色质结构。在哺乳动物细胞中催化失活的Cas9(dCas9)的结合位点的全基因组作图显示结合位点富集于开放的染色质区域。此外，在人类细胞中，CRISPR/Cas9在开放的染色质区域中诱导产生更多的插入和缺失(插入缺失，indel)。体外和体内实验已经证明，Cas9结合和切割受到染色质的基本单元核小体的抑制。与此相同的是，在HEK293T，HeLa和人成纤维细胞中，Cas9介导的基因组编辑在常染色质区域中比异染色质区域更有效。有趣的是，染色质结构对CRISPR/Cas9的脱靶活性具有更显著的抑制作用。相反，在斑马鱼中未发现染色质可及性影响CRISPR/Cas9活性。染色质可及性是否影响植物细胞中的Cas9编辑尚不清楚。
[0004]有一些研究尝试改变局部可及性以改善体内Cas9活性。proxy-CRISPR策略使用额外的催化失活的SpCas9(dCas9)在临近的位置结合。这使得目标位点对于FnCas9、CjCas9、NcCas9和FnCpf1是可及的，从而提高了编辑效率。然而，该方法依赖于SpCas9可及的基因组，并且需要两种不同CRISPR-Cas系统的共表达，这不可避免地增加了载体大小和体内应用的难度。
[0005]最近，一种称为CRISPR-chrom的方法，其中Cas9直系同源物与染色质调节肽(CMP)融合，显著提高了Cas9编辑效率，特别是在不应性位点。CMP是内源蛋白的截短形式，目前尚不清楚它们的过表达是否具有显性负面作用。
[0006]本领域需要提供进一步的方法，改进真核生物，特别是植物基因组DNA的可及性以提高编辑效率。

技术实现思路

[0007]一方面，本专利技术提供一种基因组编辑融合多肽，其包含CRISPR核酸酶结构域和转录激活结构域。
[0008]另一方面，本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，其编码本专利技术的基因组编辑融合多肽。
[0009]另一方面，本专利技术还提供一种表达载体，其包含本专利技术的多核苷酸。
[0010]另一方面，本专利技术还提供一种宿主细胞，其包含本专利技术的多核苷酸或表达载体。
[0011]另一方面，本专利技术还提供一种基因组编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
[0012]i)本专利技术的基因组编辑融合多肽和向导RNA；
[0013]ii)本专利技术的表达构建体，和向导RNA；
[0014]iii)本专利技术的基因组编辑融合多肽，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
[0015]iv)本专利技术的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
[0016]v)包含本专利技术的多核苷酸和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。
[0017]在一些实施方案中，本专利技术的基因组编辑系统还包含或编码dsgRNA，其靶向的位点与所述sgRNA靶向的位点相距30-300bp，优选40-270bp，最优选115-120bp。
[0018]另一方面，本专利技术还提供一种宿主细胞，其包含本专利技术的多核苷酸或表达载体或本专利技术的基因组编辑系统。
[0019]另一方面，本专利技术还提供一种对细胞进行遗传修饰的方法，包括将本专利技术的基因组编辑系统引入细胞，优选植物细胞。
附图说明
[0020]图1显示染色质可及性对水稻Cas9基因组编辑效率的影响。图1a总结了在70个靶位点的CRISPR/Cas9介导的突变数和染色质可及性。通过PCR/RE在再生的T0水稻植物上测量诱变效率。每个靶位点的可及性是从Zhang et al.,2012生成的水稻DNase I超敏(DH)位点的高分辨率图谱中获得的。图1b显示在原生质体中检测的20个水稻基因中的40个目标位点的indel频率。在每个基因中通过独立的sgRNA靶向两个位点。通过对靶向扩增子进行测序来测量indel频率。数据来自三组独立的生物学重复(n＝3)，并显示为平均值
±
s.e.m.。图1c总结了图1b中40个目标位点的插入频率和染色质状态。通过双尾Mann-Whitney检验计算P值。**P<0.01，***P<0.001。
[0021]图2显示水稻中Cas9编辑在开放染色质区域比在封闭染色质区域更有效。a分别成对比较了在开放和封闭染色质区域中sgRNA靶向位点的indel频率。通过对靶向扩增子进行测序，测量水稻原生质体中的indel频率。数据来自三组独立的生物学重复(n＝3)，并显示为平均值
±
s.e.m.。b总结了a中的Cas9编辑效率。通过双尾Mann-Whitney检验计算P值，*P<0.05。c显示Cas9在无染色质状态下对所有10个靶位点的切割相同。将含有相应靶位点的PCR产物与Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物一起温育，并在琼脂糖凝胶上观察和测量。数据来自三个独立的生物学重复(n＝3)，并显示为平均值
±
s.e.m.。d显示在10个靶位点生成的indel模式。所有实验重复三次，结果相似。
[0022]图3显示将合成的转录激活结构域与Cas9融合提高了其编辑效率。a是转录激活结构域与Cas9的融合物(Cas9-TV)结构的示意图。b显示在水稻原生质体中的20个靶点由Cas9和Cas9-TV诱导的indel频率。未处理的原生质体样品用作对照。数据来自三组独立的生物学重复(n＝3)，并显示为平均值
±
s.e.m.。c显示Cas9和Cas9-TV在20个靶位点诱导的indel频率。d显示Cas9和Cas9-TV诱导的开放染色质区域靶位点的插入频率。e显示Cas9和Cas9-TV在封闭染色质区域靶位点诱导的indel频率。P值由双尾Mann-Whitney检验计算。*P<
0.05，***P<0.001。
[0023]图4显示dsgRNA的近端靶向增强了Cas9-TV编辑。a显示在水稻原生质体中的20个靶位点处的Cas9/sgRNA，Cas9-TV/sgRNA和Cas9-TV/sgRNA-dsgRNA的indel频率。未处理的原生质体样品用作对照。通过对靶向扩增子进行测序来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因组编辑融合多肽，包含CRISPR核酸酶结构域和转录激活结构域(TAD)，优选地，所述转录激活结构域与所述CRISPR核酸酶结构域的C末端融合。2.权利要求1的基因组编辑融合多肽，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9或Cpf1。3.权利要求1或2的基因组编辑融合多肽，其中所述转录激活结构域包含一或多个VP16-TAD。4.权利要求1-3任一项的基因组编辑融合多肽，其中所述转录激活结构域包含一或多个TALE-TAD。5.权利要求1-4任一项的基因组编辑融合多肽，其中所述转录激活结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。6.权利要求1-5任一项的基因组编辑融合多肽，还包含一或多个核定位序列，优选两个，优选地，其中一个核定位序列位于所述CRISPR核酸酶结构域的N末端，一个核定位序列位于CRISPR核酸酶结构域的C末端与所述转录激活结构域的N末端之间。7.一种改进的基因组编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：i)权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱金龙，刘关稳，尹康权，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：